大黃蒽醌苷對大鼠腦缺血再灌注損傷及腸道菌群的影響

虞夏暉，朱雨晴，王于俊，徐義培，郭 瑩

（浙江中醫藥大學生命科學學院，浙江 杭州 310053）

缺血性腦卒中即為現代醫學中的缺血性腦血管病，是指血管阻塞引起腦缺血、缺氧損傷進而導致局灶或全腦的功能障礙，具有發病率高、致殘率高、復發率高等特點，嚴重危害人類健康［1］。目前為止，臨床上的首要治療原則是使缺血腦組織盡早恢復或再通血液灌注，重新獲得血氧供應，但這些治療措施在使閉塞腦血管再通的同時常使缺血組織病理損害加重甚至不可逆，臨床癥狀惡化，這種現象被稱為腦缺血再灌注損傷［2］。近年來研究表明，腸道菌群在缺血性腦卒中的發生發展中起到重要作用［3-4］。Benakis 等［5］報道腸道菌群可通過調節腸道 γδT 細胞，從而影響缺血性腦卒中的損傷。

大黃是我國傳統的四大中藥之一，具有瀉下通便、活血逐瘀等多種功效［6］，蒽醌苷作為其中主要的有效成分，對大鼠腦缺血損傷具有顯著保護作用［7］，但其防治機制尚不明確。現代研究表明，蒽醌苷類成分難以吸收，大多滯留于腸道發揮藥效作用［8］，大黃蒽醌苷對腦缺血性損傷的治療作用可能和其在腸道的位置有關，也有文獻形式中藥苷類成分藥效的發揮和腸道菌群的相互作用有關［9-10］。本實驗旨在研究大黃蒽醌苷對腦缺血再灌注損傷大鼠的治療效果，并比較該成分對腸道菌群的影響，探討其抗腦缺血性損傷機制與腸道菌群的相關性。

1 材料

1.1 動物 健康清潔級SD 大鼠，雄性，體質量（280±20）g，購自浙江省實驗動物中心，實驗動物生產許可證號SCXK（浙）2014-0001。

1.2 試藥 藥用大黃Rheum officinaleBaill（浙江天道醫藥有限公司，批號 170302）。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）、乳酸（LD）、乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒（上海源葉生物科技有限公司）；TTC 染料（美國 Sigma 公司）；伊紅美蘭培養基（EMB）、膽鹽-七葉苷-疊氮鈉瓊脂、雙歧桿菌選擇性培養基（BBL）、乳酸桿菌選擇性培養基（LBS）（青島海博生物科技有限公司）；其余試劑均為分析純。

1.3 儀器 SpectraMax M3 酶標儀（美國 MD 公司）；FA2 104N 電子分析天平（上海菁海儀器有限公司）；DRP-9272電熱恒溫培養箱（上海森信實驗儀器有限公司）；SW-CJ-2G 型雙人凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）。

2 方法

2.1 分組與給藥 乙醇回流提取法得到蒽醌粗提取物，再以70%甲醇，葡聚糖凝膠LH-20 柱色譜純化得到蒽醌苷提取物［11］，按后續實驗要求用蒸餾水將提取物配制成不同質量濃度。大鼠隨機分為假手術組、模型組及大黃蒽醌苷高、中、低劑量組（30、15、7.5 m／kg），每組 9 只。大鼠腦缺血再灌注同時灌胃給藥，連續 7 d，1 次／d，假手術組、模型組大鼠灌服等量生理鹽水。

2.2 模型建立 大鼠稱定質量后，腹腔注射10%水合氯醛（劑量 300 mg／kg）麻醉，參考 Longa 等［12］報道的方法建立大腦中動脈局灶性栓塞（MCAO）模型，假手術組大鼠不插栓線。缺血60 min 后抽出栓線，松開頸總動脈夾作再灌注，以大鼠蘇醒后出現同側Horner 征和對側前肢提爪為造模成功。

2.3 神經功能評分 大鼠灌胃給藥7 d 后，參考Longa等［12］報道的5 分制評分法進行評分：無精神損傷癥狀，為0 分；不能完全伸展對側前爪，為1 分；向對側轉圈，為 2分；向對側傾倒，為 3 分；不能自發行走，意識喪失，為4 分。

2.4 腦梗死范圍百分比測定 大鼠灌胃給藥7 d 后麻醉，斷頭取腦，生理鹽水沖洗殘血，-20 ℃下速凍20 min，置于腦槽中切片，TTC 染色，Image J 軟件測定腦梗死范圍百分比。

2.5 腦組織指標檢測 取大鼠缺血側腦組織，稱定質量后加生理鹽水制成10%組織勻漿，3 000 r／min 離心10 min，取上清液，-20 ℃下保存。按試劑盒說明操作步驟測定腦組織中 SOD、NOS、LDH 活性及 MDA、LD、NO、IL-1β、TNF-α 水平。

2.6 腸道菌群檢測［13］分別在灌胃給藥 1、7 d 后，無菌條件下收集大鼠糞便，各組取0.1 g，置于裝有玻璃珠的無菌試管中，按1 ∶9 比例加入滅菌生理鹽水渦旋振蕩至糞便均勻化，10 倍稀釋法用生理鹽水將糞便懸液依次稀釋至10-8濃度。選用合適的稀釋液作為腸道菌群檢測液進行選擇性培養，取50 μL 適宜稀釋度的菌懸液接種于各選擇性培養基上，涂布均勻，平行3 次，大腸桿菌和腸球菌于37 ℃下培養24 h，雙歧桿菌、乳酸桿菌于37 ℃下厭氧培養48 h，以菌落形態、革蘭氏染色和生化反應鑒定細菌，計算各平板上菌落數，結果以每1 g 糞便中菌落數的對數值表示（l g CFU／g）。

2.7 統計學分析 通過SPSS 17.0 軟件進行處理，數據以（）表示，組間均數比較采用單因素方差分析（one way ANOVA）和 LSD 檢驗。P＜0.05 表示有統計學意義。

3 結果

3.1 大黃蒽醌苷對大鼠神經功能評分的影響 表1顯示，與假手術組比較，模型組大鼠神經功能評分顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，大黃蒽醌苷高、中劑量組大鼠其評分顯著降低（P＜0.01）。

表1 大黃蒽醌苷對大鼠神經功能評分、腦梗死范圍百分比的影響（， n=9）

表1 大黃蒽醌苷對大鼠神經功能評分、腦梗死范圍百分比的影響（， n=9）

注：與假手術組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

組別 劑量／（mg·kg-1）神經功能評分／分腦梗死范圍百分比／%假手術組 — 0.00±0.00 0.00±0.00模型組 — 2.44±0.53?? 26.79±4.38??大黃蒽醌苷低劑量組 7.5 2.00±0.71 23.64±3.64大黃蒽醌苷中劑量組 15 1.50±0.85△△ 16.97±1.69△△大黃蒽醌苷高劑量組 30 1.22±0.67△△ 9.65±1.55△△

3.2 大黃蒽醌苷對大鼠腦梗死范圍百分比的影響 表1顯示，與假手術組比較，模型組大鼠腦梗死范圍百分比顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，大黃蒽醌苷高、中劑量組大鼠其百分比顯著降低（P＜0.01）。然后，大鼠斷頭取腦，TTC 染色，測定腦梗死體積，結果見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織TTC 染色

3.3 大黃蒽醌苷對 SOD、NOS、LDH 活性及 MDA、LD、NO、IL-1β 和 TNF-α 水平的影響 表2顯示，與假手術組比較，模型組 SOD 活性顯著降低（P＜0.01），NO、LD、MDA 水平及 NOS、LDH 活性顯著提高（P＜0.01）；與模型組比較，大黃蒽醌苷高、中劑量組上述指標顯著改善（P＜0.05，P＜0.01），以高劑量組更明顯。

表2 大黃蒽醌苷對 SOD、NOS、LDH 活性及 MDA、LD、NO、IL-1β 和 TNF-α 水平的影響（， n=9）

表2 大黃蒽醌苷對 SOD、NOS、LDH 活性及 MDA、LD、NO、IL-1β 和 TNF-α 水平的影響（， n=9）

注：與假手術組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 SOD／（U·mg prot-1）MDA／（nmol·mg prot-1 ）LD／（mmol·g prot-1 ）LDH／（U·mg prot-1）NO／（μmol·g prot-1 ）NOS／（U·mg prot-1）假手術組 327.95±47.57 1.84±0.38 1.05±0.28 13.77±5.09 12.44±1.86 2.54±0.72模型組 193.92±38.10?? 4.61±1.15?? 2.03±0.49?? 23.75±3.09?? 18.08±2.92?? 3.65±0.29??大黃蒽醌苷低劑量組 220.15±22.71 4.10±1.19 2.11±0.46 23.74±2.55 15.52±1.98 3.45±0.35大黃蒽醌苷中劑量組 272.77±48.03△△ 2.34±0.70△△ 1.55±0.42 19.78±2.43 14.70±1.63△ 2.97±0.51△大黃蒽醌苷高劑量組 296.49±36.72△△ 2.03±0.48△△ 1.32±0.24△ 17.10±3.32△ 13.04±2.73△△ 2.67±0.68△△

3.4 大黃蒽醌苷對 IL-1β、TNF-α 水平的影響 表3顯示，與假手術組比較，模型組 IL-1β、TNF-α 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，大黃蒽醌苷高、中劑量組兩者水平顯著降低（P＜0.01）。

表3 大黃蒽醌苷對IL-1β、TNF-α水平的影響（， n=9）

表3 大黃蒽醌苷對IL-1β、TNF-α水平的影響（， n=9）

注：與假手術組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

組別 劑量／（mg·kg-1）IL-1β／（pg·mL-1）假手術組 — 234.56±36.70 188.67±30.60模型組 — 363.33±67.47?? 280.74±54.55??大黃蒽醌苷低劑量組 7.5 320.56±55.03 226.83±42.90大黃蒽醌苷中劑量組 15 271.89±42.46△△ 202.22±27.62△△大黃蒽醌苷高劑量組 30 265.74±39.28△△ 202.41±30.94△△TNF-α／（pg·mL-1）

表4 大黃蒽醌苷對腸道菌群的影響（lgCFU／g，， n=9）

表4 大黃蒽醌苷對腸道菌群的影響（lgCFU／g，， n=9）

注：與假手術組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

時間／d 組別 大腸桿菌 腸球菌 乳酸桿菌 雙歧桿菌1假手術組 6.21±0.46 4.71±0.38 7.22±0.15 7.97±0.19模型組 7.78±0.23?? 6.82±0.26?? 6.26±0.23?? 6.98±0.19??大黃蒽醌苷低劑量組 7.81±0.11 6.71±0.21 6.33±0.34 7.28±0.17△大黃蒽醌苷中劑量組 7.56±0.26 6.46±0.17 6.38±0.27 7.38±0.17△大黃蒽醌苷高劑量組 7.09±0.20 6.14±0.07△△ 6.72±0.14△ 7.58±0.11△△7假手術組 6.28±0.44 4.82±0.13 7.28±0.24 7.99±0.23模型組 8.40±0.09?? 7.75±0.16?? 5.77±0.20?? 6.39±0.06??大黃蒽醌苷低劑量組 7.89±0.48△ 7.33±0.33△ 5.90±0.21 7.36±0.23△△大黃蒽醌苷中劑量組 7.15±0.30△△ 6.65±0.21△△ 6.50±0.25△△ 7.61±0.07△△大黃蒽醌苷高劑量組 6.35±0.30△△ 5.60±0.30△△ 6.83±0.21△△ 7.82±0.15△△

3.5 大黃蒽醌苷對腸道菌群的影響 表4顯示，給藥1 d后與假手術組比較，模型組大腸桿菌、腸球菌菌落數的對數值顯著升高（P＜0.01），乳酸桿菌、雙歧桿菌菌落數的對數值顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，大黃蒽醌苷低、中劑量組雙歧桿菌菌落數的對數值顯著升高（P＜0.05），高劑量組能顯著抑制腸球菌生成，促進雙歧桿菌、乳酸桿菌生成（P＜0.05，P＜0.01）。給藥 7 d 后與假手術組比較，模型組大腸桿菌、腸球菌菌落數的對數值顯著升高（P＜0.01），乳酸桿菌、雙歧桿菌菌落數的對數值顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，大黃蒽醌苷組（除低劑量組對乳酸桿菌無顯著影響外）顯著抑制大腸桿菌、腸球菌生成（P＜0.05，P＜0.01），促進乳酸桿菌、雙歧桿菌生成（P＜0.01）。

圖2顯示，假手術組中4種菌菌落數的對數值無明顯變化（P＞0.05）；模型組大腸桿菌、腸球菌菌落數的對數值顯著上升，乳酸桿菌和雙歧桿菌菌落數的對數值顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）；大黃蒽醌苷組隨著劑量增加，大腸桿菌、腸球菌菌落數的對數值呈下降趨勢，乳酸桿菌和雙歧桿菌菌落數的對數值逐漸增加。

4 討論

近年來，“菌-腸-腦”軸概念的提出為研究腸道菌群與腦卒中預后提供新的思路和方法，腸道可通過內分泌系統、免疫系統、迷走神經、一些胃腸激素和神經遞質等與大腦相互作用［14-15］，越來越多的研究表明，腸道菌群與中樞神經系統疾病的發生發展密切相關［16］。本實驗顯示，與假手術組比較，模型組大鼠腸道內大腸桿菌、腸球菌菌落數的對數值明顯增加，乳酸桿菌、雙歧桿菌菌落數的對數值顯著減少，而大黃蒽醌苷可顯著逆轉上述現象，表明大鼠腦缺血再灌注損傷后腸道正常微生態平衡受到破壞，而大黃蒽醌苷可使腦缺血后腸道菌群失衡狀態得到一定改善。

缺血性腦卒中可引發腸道微生物紊亂，損害胃腸道菌群的功能；反之，腸道微生物改變也會通過炎癥反應等來影響大腦損傷的預后［3］。國外報道顯示，腸道菌群可有效調節淋巴細胞數量，如調節性 T 細胞（Treg）和 γ δ T 細胞，其失調會對 Treg 細胞和白細胞介素（IL）17＋γδT 細胞產生影響，并且兩者均參與缺血性腦損傷［17］；Benakis等［5］在IS 小鼠模型中發現，缺血性腦損傷急性期后Treg 細胞在缺血組織出現，并分泌大量抗炎細胞因子（IL-10），進而起到神經保護作用；卒中發生后腸道菌群從胃腸道轉移到胃腸道以外的器官，應激狀態也能促進菌群由消化道轉移至血液，從而誘發系統的免疫和炎癥反應［18］，而免疫和炎癥反應已被證實是腦缺血損傷發生機制中的關鍵環節［17］。本實驗顯示，與假手術組比較，模型組大鼠腦組織IL-1β、TNF-α 水平明顯提高，而大黃蒽醌苷可有效降低，表明該成分能有效抑制炎癥反應，進而改善腦缺血再灌注損傷。

正常的腸道菌群結構失衡時，將導致腸黏膜屏障受損，上皮細胞分泌產生更多的活性氧（ROS）［19］；SOD 為人體最重要的自由基清除劑，但過多的氧自由基將大量消耗該因子，從而降低其活性［20］，而大量 ROS 能攻擊生物膜中不飽和脂肪酸，導致脂質過氧化產物MDA 大量產生，損傷組織 DNA［21］；NO 以L-精氨酸為底物，在一氧化氮合酶（NOS）催化下產生［22］。研究表明，腸道菌群的紊亂、移位可導致腸道內毒素大量產生，內毒素又可通過誘導NOS合成NO，后者過量時可誘導神經細胞凋亡［23］。本實驗顯示，與假手術組比較，模型組大鼠腦組織SOD 活性降低，MDA、NO 水平升高，而大黃蒽醌苷可逆轉上述現象。

LD 是腸道菌群固有的產物，腸道菌群失調大量繁殖會導致其水平明顯升高，進而促進 LDH 活性提高［24］。本實驗顯示，腦缺血損傷提高大鼠腦組織LD 水平、LDH 活性，表明過多的LD 會損傷腦組織。

圖2 大黃蒽醌苷對腸道菌群的影響

蒽醌苷作為常見糖苷類物質，由于其苷類結構特點而在機體腸道中難以直接吸收利用，需要通過與腸道菌群的相互作用來發揮藥效［9］。本實驗推測大黃蒽醌苷可能通過調節腦缺血再灌注損傷大鼠腸道菌群，維護腸道微生態平衡，從而緩解炎癥反應、氧自由基損傷等，并改善腦缺血性損傷。但目前還無法確認腸道菌群在大黃蒽醌苷治療大鼠腦缺血性損傷中是否起到主導作用，尚有待進一步研究。