鼻寧噴霧劑對急性鼻竇炎大鼠的治療作用

王 森，歐水平，陳 莉，呂佳佳，王治凱，熊永愛?

（1.遵義醫科大學，貴州 遵義 563003；2.遵義醫科大學附屬醫院藥劑科，貴州 遵義 563099）

鼻寧噴霧劑是由鵝不食草、一枝黃花經水提醇沉而制得的鼻科苗藥獨家品種，具有疏風解表、清熱通竅之功效，臨床主要用于急性、慢性單純性和過敏性鼻炎治療［1-2］。研究表明，鼻炎和鼻竇炎發病機制密切相關，前者是指以鼻腔黏膜炎癥為特征的病癥；后者是指以鼻竇黏膜炎癥為特征的病癥，常繼發于前者，在大多數個體中兩者通常共存，故鼻-鼻竇炎是指以鼻腔和鼻竇黏膜炎癥為特征的病癥，治療時先以藥物控制鼻腔和鼻竇炎癥至關重要［3-4］。但目前國內外未見鼻寧噴霧劑用于治療鼻竇炎的報道，故本實驗研究該制劑對急性鼻竇炎大鼠的治療作用，從而為其鼻科適應癥的拓展奠定基礎，對拓展其臨床適應證、擴大優質品種的市場占有率也具有重要意義。

1 材料

1.1 動物 清潔級 SD 大鼠，雄性，體質量 180～220 g，購自第三軍醫大學大坪醫學實驗動物中心，許可證號SCXK（渝）2010-0005。

1.2 試藥 鵝不食草、一枝黃花購自貴州省畢節市玲源中藥材行，經遵義醫學院楊建文老師鑒定分別為鵝不食草Centipeda minima（L.）A.Br.et Aschers.、一 枝 黃 花Solidago decurrensLour.的干燥全草。丙酸氟替卡松鼻噴霧劑（批號H20091100，英國葛蘭素史克公司）。大鼠TNF-α ELISA 試劑盒（批號 ADI-900-086A）、IL-6 ELISA 試劑盒（批號ADI-900-045）（欣博盛生物科技有限公司）。綠原酸、蘆丁對照品（批號分別為 110753-201415、100080-201409，中國食品藥品檢定研究院）；異綠原酸A 對照品（批號151028，成都普菲德生物技術有限公司）。乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；水為重蒸水。

1.3 儀器 Agilent 1260 液相色譜儀，配置 DAD 檢測器（美國 Agilent 公司）；BT125D 電子天平（德國 Sartorius 公司）；JA1002 電子天平（上海蒲春計量儀器有限公司）；98-II-B 磁力攪拌電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；RE-2000A 旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；Exceed-Cd-20 實驗室超純水機（成都艾科水處理設備有限公司）；MK3 型多功能酶標儀（美國 Thermo Fisher 公司）；BA200 Digital 數碼三目攝像顯微攝像系統（麥克奧迪實業集團有限公司）。

2 方法

2.1 噴霧劑制備 取鵝不食草120 g、一枝黃花500 g，加水浸潤12 h，水蒸氣蒸餾，收集芳香水約為藥材的3 倍量，藥渣加水蒸煮 3 次，第 1 次 2 h，第 2、3 次各 1.5 h，合并煎煮，濾過，濾液濃縮至相對密度為 1.15（60 ℃）的清膏。芳香水加10 g 聚山梨酯 80，加入清膏，攪勻，加 9 g氯化鈉調節等滲后加入山梨酸，用磷酸氫二鈉調pH 至4.0～6.0，加水至 1 000 mL，攪勻，靜置，取上清液，按每瓶 10 mL 灌裝至噴瓶中，即得［1］。

2.2 綠原酸、蘆丁、異綠原酸A 含有量測定

2.2.1 溶液制備 精密稱取綠原酸、蘆丁、異綠原酸A 對照品適量，50%甲醇制成每1 mL 分別含三者140、403.6、322.56 μg 的對照品溶液。將噴霧劑用 0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，作為供試品溶液。

2.2.2 色譜條件［5］Neptune C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.2% 磷酸（B），梯度洗脫（0～15 min，10%～15%A；15～25 min，15%～20%A；25～55 min，20%～35%A；55～65 min，35%～10%A）；體積流量 1.0 mL／min；檢測波長 326 nm；柱溫 25 ℃；進樣量10 μL。

2.2.3 線性關系考察 取 “2.2.1”項下對照品溶液，50%甲醇逐級2 倍稀釋，在 “2.2.2”項色譜條件下進樣測定，以峰面積（Y）對質量濃度（X）進行線性回歸。

2.2.4 精密度、穩定性、重復性試驗 在 “2.2.2”項色譜條件下，取同一供試品溶液進樣測定6 次，考察精密度；于 0、2、4、6、8、12 h 進樣測定，考察穩定性；取同一批噴霧劑，按 “2.2.1”項下方法平行制備6 份供試品溶液，進樣測定，考察重復性。

2.2.5 加樣回收率試驗 精密量取綠原酸、蘆丁、異綠原酸 A 含有量已知的噴霧劑6 份，每份2 mL，置于 10 mL 量瓶中，精密加入對照品溶液適量，蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，按 “2.2.2”項下色譜條件進樣測定，計算回收率。

2.2.6 樣品含有量測定 取噴霧劑，按 “2.2.1”項下方法制備供試品溶液，在 “2.2.2”項色譜條件下進樣測定，外標法計算含有量。

2.3 模型建立 依據Ge 等［6］報道的方法并加以改進，取大鼠70 只，腹腔注射鹽酸氯胺酮 0.5 mg／kg，必要時用一般劑量重復1 次，進行全麻；鹽酸利多卡因20 mg／mL 加腎上腺素0.125 mg，進行鼻背下注射麻醉，剃毛，碘伏消毒備皮，在鼻中線上中 1／3 交界處旁開 3 mm，以 45°進針1.5 mm，置石蠟適量于內封口，然后塞入適量帶有金黃色葡萄球菌的明膠海綿于內，由于是微創，不必縫合，上述過程在顯微鏡下操作以確保操作準確性，以噴嚏、流涕、鼻腔分泌物等為評價標準判斷模型成功與否。

2.4 分組與給藥 取造模成功的大鼠50 只，按體質量和鼻竇炎評分標準（≥6 分）隨機分為 5 組，每組 10 只，分別為模型組（生理鹽水）、陽性組（40 μg／kg 丙酸氟替卡松鼻噴霧劑）、鼻寧噴霧劑高劑量組（0.182 g／kg）、鼻寧噴霧劑中劑量組（0.091 g／kg）、鼻寧噴霧劑低劑量組（0.045 5 g／kg），另取 10 只正常大鼠作為正常組，各組通過鼻腔滴鼻給藥，2 次／d（早晚各 1 次），連續 14 d。第 15天，大鼠股動脈取血，3 000 r／min 離心 10 min，收集上清液，-20 ℃保存待測，再斷頸處死大鼠，剖取鼻竇黏膜（手術刀劃取左側竇口1 mm×1 mm 黏膜）。

2.5 指標檢測

2.5.1 鼻部外觀體征及鼻竇炎癥狀評分 造模、給藥后，觀察大鼠鼻部癥狀和體征，主要包括鼻癢、噴嚏、流涕等，分別與給藥前后觀察記錄各實驗組大鼠鼻竇炎癥狀，并按表1 評分標準進行評分［7］。

表1 鼻竇炎癥狀評分標準

2.5.2 鼻竇黏膜病理組織學檢查 將大鼠鼻竇黏膜組織按病理檢驗 SOP 程序進行脫水、修剪、包埋、切片、染色、封片等，最后鏡檢。數碼3 目攝像顯微攝像系統對切片進行圖像采集，每張切片先于40 倍下觀察全部組織大體病變，再采集100、400 倍圖片觀察具體病變。

2.5.3 血清TNF-α、IL-6 水平測定 取大鼠股動脈血液，3 000 r／min 離心 10 min，取上清液，ELISA 法檢測血清TNF-α、IL-6 水平。

2.6 統計學分析 通過SPSS 軟件進行處理，數據以（）表示，組間采用單因素方差分析，方差齊者進行LSD 檢驗，方差不齊者進行 Tamhane’s T2 檢驗，以P＜0.05 為有顯著性差異；等級資料比較采用非參數檢驗方法Kruskal-Wallis H 檢驗，組間兩兩比較采用 Nemenyi 檢驗，α=0.05，以P＜0.05 為有顯著性差異。

3 結果

3.1 方法學考察與含有量測定 HPLC 色譜圖見圖1。綠原酸、蘆丁、異綠原酸A 回歸方程分別為Y=28.277 2X＋621.641 7（r= 1.000 0）、Y= 11.075 8X-3.900 0（r=1.000 0）、Y=38.258 7X-415.087 5（r=0.999 3），線性范圍 分 別 為 8.75～140、25.225～403.6、20.16～322.56 μg／mL。精密度、穩定性、重復性試驗的 RSD 均未超過0.57%（n=6），供試品在 12 h 內穩定性良好；平均加樣回收率97.76%～101.74%，RSD≤2.08%（n=6）。綠原酸、蘆丁、異綠原酸 A 含有量分別為 24.75、133.06、71.31 μg／mL，符合鼻寧噴霧劑質量標準。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

3.2 外觀體征、鼻竇炎評分、病理損傷評分 除正常組外各組大鼠造模后均抓撓鼻、面不止，到處摩擦、打噴嚏，有鼻涕流出，治療10 d 后明顯好轉；與模型組比較，給藥組大鼠打噴嚏、流鼻涕情況明顯減輕，其中鼻寧噴霧劑給藥高劑量組、陽性組整體狀態最好。表2顯示，造模后各組鼻竇炎評分較造模前顯著升高（P＜0.01），而給藥后鼻寧噴霧劑組該評分較模型組顯著降低（P＜0.05）。

圖2顯示，模型組大鼠鼻竇黏膜組織黏膜上皮和固有層排列、分界清晰，黏膜層和黏膜下層分界不清，黏膜層顯著增厚，黏膜上皮細胞脫落或潰爛，黏膜層和黏膜下層大量的炎細胞浸潤，其中包括較多的淋巴細胞和中性粒細胞；鼻寧噴霧劑組大鼠黏膜上皮和固有層排列、分界清晰，纖毛上皮排列整齊，偶見有個別組織內可見炎細胞浸潤。再對大鼠鼻竇黏膜組織炎性損傷情況按文獻［8］標準進行評分，結果見表2，可知與正常組比較，模型組大鼠鼻竇黏膜組織炎性病變顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，鼻寧噴霧劑組大鼠其炎性損傷顯著減少（P＜0.05）。

表2 鼻寧噴霧劑對大鼠鼻竇炎評分與鼻竇黏膜組織炎性損傷評分的影響（， n=10）

表2 鼻寧噴霧劑對大鼠鼻竇炎評分與鼻竇黏膜組織炎性損傷評分的影響（， n=10）

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05

組別 鼻竇炎評分給藥前 給藥后 鼻竇黏膜組織炎性損傷評分正常組 0.13±0.012 0.11±0.015 1.39±0.51模型組 7.48±0.37△△ 7.23±0.56△△ 12.68±3.81△△陽性組 7.52±0.61△△ 2.68±0.19? 5.76±0.21?鼻寧噴霧劑高劑量組 7.29±0.78△△ 2.12±0.15? 5.40±0.63?鼻寧噴霧劑中劑量組 7.67±0.43△△ 2.09±0.16? 6.20±0.83?鼻寧噴霧劑低劑量組 7.44±0.36△△ 2.87±0.19? 7.60±0.82?

圖2 各組大鼠鼻竇黏膜組織病理學變化（HE，×400）

3.3 TNF-α、IL-6 水平 表3顯示，與正常組比較，模型組 TNF-α、IL-6 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，鼻寧噴霧劑兩者水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表3 鼻寧噴霧劑對TNF-α、IL-6 水平的影響（，n=10）

表3 鼻寧噴霧劑對TNF-α、IL-6 水平的影響（，n=10）

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，? P＜0.05，??P＜0.01

組別 TNF-α／（pg·mL-1）IL-6／（pg·mL-1）正常組 9.96±1.14 8.43±2.84模型組 23.18±3.32△△ 18.43±3.12△△陽性組 13.31±2.56?? 8.91±2.15?鼻寧噴霧劑高劑量組 14.18±2.13?? 8.97±2.34??鼻寧噴霧劑中劑量組 15.69±2.85?? 11.24±2.41?鼻寧噴霧劑低劑量組 17.32±1.92? 13.19±1.97?

4 討論

鼻竇炎是耳鼻喉科多發病，我國發病率為8%～15%，且極易復發，難以治愈，其病因復雜，發病機制尚不明確，可能與感染、纖毛功能不良、變態反應、環境因素、細菌生物膜等多種因素有關。目前，鼻竇炎的治療仍以鼻內鏡外科手術及抗炎藥物為主，存在創傷性大、復發率高、抗生素和糖皮質激素耐藥性與不良反應等一系列問題［9-10］。

鼻腔外側壁存在著1 個不穩定組織微環境，能在誘導因子作用下分泌多種細胞因子，使得腺細胞、上皮細胞等增殖，并激活嗜酸性粒細胞等分泌炎性介質，從而導致鼻竇炎發生［11］，其中 TNF-α、IL-6 是公認的與局部炎癥反應有關的細胞因子，對鼻竇炎發生發展及病理變化有著直接而重要的影響［12-13］。其中，TNF-α 是初級炎性因子，具有多種促炎生物活性，能有效誘導包括自身在內的多種細胞因子，并活化各種炎性細胞，促進血管內皮細胞黏附白細胞，導致白細胞在炎性反應部位聚集，并促進血管通透性顯著性增加，從而加重炎癥損傷［14］；感染性疾病的發生和發展與IL-6 升高有著密切關系，它是具有促進炎性反應的細胞因子，可增強炎癥介質對組織的損害，可通過P13 K／Akt 信號通路選擇性激活 GSK3β 而增強炎癥反應［12］。

本實驗發現，大鼠感染鼻竇炎后可引起血液異常分泌TNF-α、IL-6 等促炎因子，導致促炎因子、抑炎因子平衡被打破，使得后者分泌相對不足，鼻竇產生較強的炎癥反應；鼻寧噴霧劑可明顯抑制上述促炎因子分泌，減少鼻竇黏膜組織炎性損傷，從而對大鼠鼻竇炎癥狀產生治療效果，可為拓展該制劑新適應癥、實現臨床應用價值最大化提供理論依據。