芪貞降糖顆粒與湯劑及藥材譜峰匹配特征圖譜

錢 程，楊青楠，丁麗玉，王浣清，張 丹，吳 飛?，馮 怡?

（1.復旦大學附屬華東醫院藥劑科，上海 200040；2.上海中醫藥大學創新中藥研究院，中藥現代制劑技術教育部工程研究中心，上海 201203；3.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院藥劑科，上海 200437；4.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院內分泌科，上海 200437）

芪貞降糖方是上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院用于治療2 型糖尿病或糖調節異常的經驗方，由黃芪、女貞子（制）、靈芝和烏梅（制）4 味中藥組成，在改善患者胰島素抵抗、調節糖代謝等方面療效顯著［1-4］。本課題組前期［5-7］系統開展了醫院制劑芪貞降糖顆粒的藥學研究，建立了定性和定量的質量控制方法，但尚欠缺對制劑進行整體質量控制的手段。多靶點、多組分是中藥制劑獨有的特點，當今對于中藥制劑的質量控制正越來越多地采用藥材與制劑特征圖譜譜峰相結合的方法［8-10］。本研究采用高效液相色譜-二極管陣列檢測法建立芪貞降糖顆粒的特征圖譜，通過指認圖譜中的指標性成分，比對芪貞降糖顆粒的特征圖譜與組方單味藥材的特征圖譜主要色譜峰的保留時間，得到專屬性強、重復性好的特征指標。通過本研究所建立的特征圖譜，可進一步對顆粒與臨床用芪貞降糖方湯劑進行物質一致性初步評價。

1 儀器與試藥

Agilent 1200 型 HPLC 色譜儀（DAD 檢測器，美國 Agilent 公司）；XP205 型分析天平（0.01 mg，梅特勒-托利多科技有限公司）；SQP 型電子天平（0.1 mg，賽多利斯科學儀器有限公司）；B-491 型旋轉蒸發器（瑞士Buchi 科學儀器有限公司）；TGL-18C 型高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；SK7210HP 型超聲波清洗器（上海科導超聲設備有限公司）；YM-300D 型電子煎藥壺（廣東益美生活電器有限公司）；F2 型移液槍（美國 Thermo Scientific 公司）；Milli-Q 型超純水機（密理博中國科技有限公司）；玻璃儀器均購自上海青陽生物科技有限公司。

烏梅（制）（批號 150826，浙江）、靈芝（批號151201，山東）、黃芪（批號 151112，甘肅）、女貞子（制）（批號151017，湖南）均購自上海康橋藥業有限公司，經上海中藥標準化研究中心徐紅研究員鑒定為正品。特女貞苷對照品（批號111926-201404）、枸櫞酸對照品（批號100396-201302）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號111920-201102）均購自中國食品藥品檢定研究院。3 批芪貞降糖顆粒中試產品（批號分別為1606001、1606002、1606003，20 g／袋，上海寶龍藥業有限公司加工）。水為超純水；甲醇、磷酸等試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取特女貞苷、枸櫞酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇溶解定容，即得，三者稀釋后質量濃度分別為0.110 4、0.539 0、0.051 6 mg／mL。

2.1.2 芪貞降糖顆粒溶液 稱取顆粒4 g（相當于1 d 服用量的 10%），加水定容至100 mL，超聲（350 W、53 kHz）30 min，18 000 r／min 離心 10 min，取上清液，即得。

2.1.3 芪貞降糖方湯劑 按芪貞降糖方組成（1 d 處方量）稱取黃芪 12 g、女貞子（制）12 g、靈芝 15 g、烏梅（制）15 g，加水 500 mL 浸泡 15 min，煎煮 2 次，每次30 min，將 2 次濾液合并，定容至 1 000 mL，移取溶液，18 000 r／min 離心 10 min，取上清液，即得。

2.1.4 藥材溶液 分別取芪貞降糖方中對應的各單味藥材飲片，按其在處方中對應的處方量取樣，按 “2.1.3”項下方法制備，即得。同法制備各藥材飲片的陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件［11-12］ZORBAX SB-Aq Stablebond Analytical色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相 0.1% 磷酸（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～10 min，0B；10～90 min，0～65% B）；進樣量 10 μL；檢測波長 224 nm；體積流量1.0 mL／min；柱溫 30 ℃。

2.3 方法學考察

2.3.1 穩定性試驗 取顆粒（1606003）制備的供試品溶液，于 0、2、4、6、12、24 h 在 “2.2”項色譜條件下進樣測定，以特女貞苷色譜峰為參照峰（S），得到各主要色譜峰的相對保留時間RSD≤ 0.24%，相對峰面積RSD≤1.35%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.3.2 精密度試驗 取顆粒（1606003）制備的供試品溶液，在 “2.2”項色譜條件下連續進樣6 次，以特女貞苷色譜峰為參照峰（S），測得各主要色譜峰的相對保留時間RSD≤0.18%，相對峰面積的 RSD 值≤0.74%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重 復性試驗取顆粒（1606003）6 份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在 “2.2”項色譜條件下進樣，以特女貞苷色譜峰為參照峰（S），得到各主要色譜峰的相對保留時間 RSD ≤0.20%，相對峰面積的RSD≤1.69%，表明該法重復性良好。

2.3.4 專屬性考察 取顆粒（批號1606003）、4 個單味藥材及4 個對應的陰性樣品溶液，在 “2.2”項色譜條件下測定，用 DAD 檢測器獲取并保存3D 圖譜，取224 nm 波長處的譜圖。4 個單味藥材色譜圖中均能找到與顆粒劑色譜圖中保留時間一致的色譜峰，陰性對照無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.4 特征圖譜建立［11-12］取3批顆粒（1606001～1606003）供試品溶液以及對照品溶液，在 “2.2”項色譜條件下測定，記錄色譜圖，應用 “中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”軟件將3 批樣品的色譜圖導入軟件，依次設定參照圖譜、色譜峰校正、色譜峰匹配，得到對照圖譜，見圖1。在3 批樣品中有 27 個共有峰，對比樣品色譜圖與對照品色譜圖中各峰的保留時間，可指認其中3 個，分別為枸櫞酸（2 號峰）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（20號峰）、特女貞苷（21 號峰）。各樣品間的相似度大于0.998，與對照圖譜間的相似度分別為 0.999、0.999、0.999。因此，由整體譜峰信息可知 3 批樣品質量相對穩定。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.5 制劑與湯劑譜峰匹配 取 “2.1.3”項下樣品溶液，在 “2.2”項色譜條件下進樣，記錄 90 min 內色譜圖，并與顆粒特征圖譜進行疊加，見圖2。結果顯示，樣品與顆粒特征圖譜27 個色譜峰保留時間能逐一對應，兩者相似度為0.906，表明顆粒與臨床用湯劑所含物質基本一致。

圖2 芪貞降糖顆粒與芪貞降糖方湯劑譜峰匹配圖

2.6 制劑與藥材譜峰匹配 在 “2.2”項色譜條件下測定“2.1.4”項藥材溶液，記錄90 min 內色譜圖，并與顆粒特征圖譜進行疊加，見圖3。結果顯示，各單味藥材貢獻的譜峰分別為黃芪 6 個（1、3、4、14、20、25 號峰）、女貞子 12 個（1、3、5、8、9、10、11、13、17、21、22、26號峰）、靈芝 2 個（4、27 號峰）、烏梅（制）3 個（2、6、11 號峰），其中 1、3 號峰為黃芪和女貞子（制）共有，4號峰為靈芝和黃芪共有，11 號峰為女貞子（制）和烏梅（制）共有。各單味藥材中的色譜峰大多數能與顆粒特征圖譜對應，關聯性良好，但顆粒特征圖譜中大部分色譜峰都高于單味藥材中，這可能與特征圖譜中藥材的疊加作用，以及制劑過程中的多組分助溶作用相關。

圖3 芪貞降糖顆粒與4 味藥材飲片譜峰匹配圖

3 討論

3.1 譜峰匹配特征圖譜 本課題組采用譜峰匹配特征圖譜手段對芪貞降糖顆粒開展研究，對顆粒特征圖譜中的色譜-光譜可視化成分進行了來源辨析和歸屬，以期為制劑的進一步綜合質量控制，最終為保證產品的臨床療效奠定基礎。

3.2 特征圖譜的應用 中藥特征譜技術［13-15］是目前應用比較廣泛且較受認同的中藥物質基礎一致性評價技術，在建立芪貞降糖顆粒的HPLC 特征譜的基礎上，將中試加工的芪貞降糖顆粒與湯劑進行比較，從化學特征譜角度評價顆粒在制劑工藝條件下的加工產品與原湯劑組成一致性。

3.3 相似度評價［13-15］本研究通過HPLC 建立的3 批次芪貞降糖顆粒的特征圖譜能夠綜合、全面地反映顆粒及顆粒中各單味藥材所含化學組分。不同批次樣品間相似度均高于0.998，體現了在制劑過程對顆粒及顆粒中各單味藥材所含的化學組分影響較小，制劑組分整體穩定。

3.4 色譜條件優化 分別考察了 260、224、210 nm 下得到的色譜，結果表明在224 nm 下色譜圖基線平穩、分離度較好、色譜峰最多、峰面積均衡，故選取224 nm 為檢測波長。其次對分離條件進行了考察，篩選了甲醇-水、0.2%冰醋酸-甲醇、0.1%磷酸-甲醇3種流動相，結果表明0.1%磷酸-甲醇梯度洗脫譜峰信息較多，分離度較好。本研究建立了芪貞降糖顆粒HPLC-DAD 特征圖譜，出峰數目、強度及共有峰等評價信息較好，可整體反應顆粒的物質相關特征信息。同時，結合芪貞降糖顆粒與組方單味藥材特征圖譜的譜峰匹配研究及指認特征峰等檢測手段［16-17］，初步明確了芪貞降糖顆粒組分來源歸屬，使質控結果更趨合理，可更全面綜合地控制制劑質量，但還需含有量測定、結構鑒定等相關研究作進一步驗證。