擬南芥CBL9的質膜定位對花粉管頂端生長的影響

周利明 房瑋

（華北理工大學生命科學學院，唐山 063210）

開花植物的有性繁殖需要雄性配子體營養細胞特定區域的極性生長，從而逐漸形成花粉管。通過花粉管頂端的極性擴展，花粉管向胚珠輸送精子并完成雙受精［1］。由于花粉管具備典型極性生長的特性，且體外方便培養，目前已被廣泛作為研究植物細胞極性發育的理想模式系統［2］。發掘極性生長相關的關鍵調控因子，闡述細胞極性建成與極性生長的調控機理，是植物有性生殖方面的熱點領域，同時也為提高授粉效率這一增收策略提供一定的理論依據。

花粉管的生長過程是被嚴格調控的，并且依賴大量的信號組件，而鈣離子在其中起到極其重要的作用［3-5］。鈣離子在花粉管的伸長過程中形成一定的濃度梯度，花粉管的頂端鈣離子濃度最高，而從頂端到底部濃度逐步遞減［6］。已有研究成果發現打破頂端鈣離子梯度會嚴重影響花粉管的正常生長，而鈣離子梯度偏轉會引起生長軸的重新調整［7-8］。在許多物種中，頂端富集的鈣離子梯度可以表現出周期振蕩的特征，這種振蕩與花粉管增長率的周期變化相關［5］。鈣離子泵（ACA9）、環核苷酸門控通道（CNGC18）及類谷氨酸受體（GLR1.2和GLR 3.7）的功能研究顯示它們在調控花粉管增長率、花粉管形態和與雌配子體的互作等方面都具有重要作用［9-11］。這些發現強調了鈣信號的形成及維持對花粉管極性生長的重要性。另一個重要的調控因子就是小G蛋白ROP1，其下游存在2個作用相反的效應蛋白RIC3和RIC4，前者引起微絲的解聚，而后者促進微絲的聚合。微絲動態（解聚與聚合）的正常維持才能造就花粉管的頂端生長，這一過程受到ROP1活性的嚴格調控［12］。

植物中鈣離子信號的傳遞是由一系列的鈣傳感器所介導的，鈣傳感器在與鈣離子結合后，發生構象變化并將信息傳遞給下游目標，類鈣調神經磷酸酶B亞基（Calcineurin B-like protein，CBL）就是一類典型的鈣離子傳感器家族，擬南芥基因組編碼10個CBL成員，其下游效應子是一組絲氨酸/蘇氨酸激酶，被命名為CBL互作蛋白激酶（CBL interacting protein kinase，CIPK）［13］。 不同的 CBL-CIPK復合體建立了復雜的鈣信號網絡，可以從胞內和胞外鈣庫的不同部位感知鈣信號［14-15］。CBL參與調節包括離子平衡和脅迫應對等過程在內的多種細胞過程。CBL1或CBL9協同CIPK23激活K+通道AKT1，從而使植物在低K+條件下正常生長［16］。此外，鈣傳感器CBL4/SOS3與CIPK24/SOS2的復合體調節Na+/H+反向轉運蛋白SOS1的活性，從而顯著提高植物的耐鹽性［17］。

以往的CBL相關研究主要集中于植物對環境脅迫的響應機制領域，較少涉及花粉管的極性生長領域。本研究利用基因槍瞬時表達體系，分析了CBL9及其N末端保守位點的點突變體CBL9G2A的亞細胞定位與過量表達表型情況，旨在揭示CBL9在花粉管極性生長中的功能及其調控機制，為提高授粉效率這一增收策略提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

煙草（Nicotiana tabacum）培養于溫室內，28℃恒溫，光周期為12 h/12 h。基因槍轉化前，收集新鮮的煙草花粉（每次轉化需8朵花的花粉）。擬南芥（Arabidopsis thalianaL.，col-0）生長條件為 22℃、光周期16 h/8 h。基因槍專用金粉、銅網、微載體、易裂膜等購自Bio-Rad公司（Bio-Rad，U.S.A.）。限制性內切酶、Pyrobest DNA Polymerase、dNTP及T4 DNA ligase購自六合通經貿有限公司（代理Takara的產品）。凝膠回收試劑盒以及Taq DNA Polymerase購自天根生化科技公司。Plasmid Mini Kits試劑盒的品牌為QIAGEN。T4 DNA ligase及AMV Reverse Transcriptase購自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆及表達載體的構建 選取6周齡的擬南芥花朵提取總RNA，通過反轉錄及PCR擴增獲得CBL9全長序列。基于overlap-PCR技術，將CBL9的N末端中第二位甘氨酸（Gly）定點突變為丙氨酸（Ala），獲得CBL9G2A點突變體，序列檢測正確的目的片段分別構建到瞬時表達載體pBLAT：YFP（目的片段連接到黃色熒光蛋白YFP的N末端）。

1.2.2 基因槍轉化試驗 采用Plasmid Mini Kits（QIAGEN，Germany）提取用于基因槍瞬時轉化的質粒DNA，0.8 μg質粒包裹在0.5 mg金粉上，通過基因槍瞬時轉化體系將目的質粒轉化到煙草花粉中。各項射擊參數為：易裂膜與微彈載體之間距離為2cm；微彈載體飛行距離為10 mm；微彈飛行距離為7 cm；易裂膜破裂壓力為1 100 psi；真空度為27 mm Hg。轉化完成的花粉在28℃，避光培養3-4 h后，分別通過熒光顯微鏡及共焦掃描顯微鏡對各自過表達表型及亞細胞定位進行觀察與測量。

1.2.3 熒光顯微鏡分析花粉管表型 將轉化獲得的花粉管放在OLYMPUS熒光倒置顯微鏡（MODE BX51）下觀察，顯微鏡配備的CCD攝像機（MODE DP70，OLYMPUS）用于拍攝轉化成功的花粉管。3次獨立的轉化試驗所獲得的照片通過Zeiss LSM圖像瀏覽器（3.2版）進行測量分析（80根左右花粉管的長度及頂端最寬處的直徑）。

1.2.4 共焦激光掃描顯微鏡觀察亞細胞定位 通過共焦激光掃描顯微鏡（Model LSM 510 META，Zeiss）進行花粉管中CBL9-YFP或CBL9G2A-YFP的亞細胞定位分析，顯微鏡激發光波段為488 nm，接受光波段為505-530 nm，通過Zeiss LSM圖像瀏覽器（3.2版）進行相應的圖像分析。

2 結果

2.1 CBL9在成熟花粉中高量表達分析

目前，擬南芥鈣傳感器主要有4個基因家族：鈣調素（CaM）、類鈣調素（CML）、類鈣調神經磷酸酶B亞基（CBL）以及鈣離子依賴蛋白激酶（CPK）。CBL家族包含10個成員。基于網上公布的基因芯片數據（https：//www.genevestigator.ethz.ch/），生成CBL全家族成員的表達熱圖（Expression heatmap），通過顏色的深淺反映不同的CBL在各組織細胞中的表達情況（圖1）。CBL1主要在葉（保衛細胞及葉肉細胞）與根（根冠及中柱）組織中表達，CBL2、CBL3、CBL8及CBL9在成熟花粉中相對表達較高，而在其他組織中表達較少，或者不表達。CBL4與CBL10分別主要在花柄離區和莖尖中表達。CBL5-CBL7依次主要在下胚軸、柱頭及根冠中表達。CBL9作為花粉高量表達的典型代表，被選為進一步研究的對象。

圖1 CBL家族成員在各組織中的表達熱圖

2.2 花粉高量表達CBL9的亞細胞定位及過表達表型分析

利用基因槍技術將CBL9在煙草花粉中進行瞬時表達，經過3-4 h的花粉培養，在共焦掃描顯微鏡下，單獨表達YFP的花粉管熒光呈彌散分布。而YFP標記的CBL9則在花粉管質膜上有清晰的表達（圖2-A）。CBL9-YFP定位于胞內隨著胞質環流運動的顆粒狀細胞器上（圖2-A）。通過生物學統計分析，大約80根花粉管的長度以及花粉管頂端的最寬處直徑被測量統計（圖2-B），與對照相比，過表達CBL9的花粉管長度顯著縮短，且寬度顯著增加。

圖2 CBL9在花粉管中的定位（A）與過表達表型統計（B）

2.3 CBL9的質膜定位

CBL9的N末端存在一個保守的氨基酸位點（圖3-A），即第二位的甘氨酸位點，此位點對于CBL1的花粉管質膜定位至關重要［18］。CBL9與CBL1的序列相似度超過89%，為了驗證該位點的作用同樣適用于CBL9，將CBL9的第二位甘氨酸（G）定點突變為丙氨酸（A），從而構建CBL9的點突變體（CBL9G2A）。

花粉管亞細胞定位的觀察結果（圖3-B）顯示，CBL9-YFP有明顯的質膜定位，然而CBL9G2A-YFP呈現出與YFP對照相一致的胞質彌散分布。

表型量化結果（圖3-C-D）顯示，過量表達CBL9G2A并沒有顯著影響花粉管的極性生長，即花粉管的長度及寬度與對照沒有顯著差異。表明CBL9在花粉管中的功能發揮與其質膜定位密切相關。

圖3 CBL9點突變體在花粉管中的定位與表型分析

3 討論

鈣離子是花粉管極性生長中至關重要的調節因子［4，19］。然而，對于花粉管中鈣離子信號如何被感知和傳遞并觸發下游反應的認識卻十分有限，迄今為止，只有少數信號組分已確定影響花粉管的萌發或生長。本研究通過基因槍技術，在煙草花粉中瞬時過量表達CBL9會使花粉管的頂端生長形態發生改變，即花粉管長度縮短，頂端腫脹。這一結果與Mahs等［18］所得出的結論相一致，進一步印證了CBL9在花粉管頂端生長中發揮重要的作用。另外，亞細胞定位結果顯示CBL9主要定位于花粉管的質膜及顆粒狀細胞器，相似的定位同樣體現在CBL9的同源基因CBL1（氨基酸相似度為89%）上。在前人的研究中［18］，CBL1可以和標記囊泡的染料FM4-64共定位，由此推測CBL9所定位的顆粒狀細胞器也可能為胞內囊泡系統。花粉管的質膜是介導細胞內外信號傳導與物質交換的屏障，胞外的鈣離子通過位于質膜上的離子通道，內流到花粉管中，從而參與形成花粉管頂端的鈣離子梯度。維持正常的頂端鈣離子梯度對于花粉管生長的速率與導向至關重要［1］。目前，多個離子通道參與該調控過程，其中包括環核苷酸門控通道（Cyclic nucleotide gated channel，CNGC）及類谷氨酸受體（Glutamate receptor-like，GLR）等。質膜定位的CNGC18過量表達導致花粉管的異常生長，并伴隨著胞內鈣離子在頂端的過量聚集［10，20］。另外，GLR1.2和GLR3.7是一類配體門控的離子通道，促進鈣離子通過質膜流入胞內，在生成鈣信號和濃度梯度等方面發揮關鍵功能［9］。由此可以推測質膜定位的CBL9可能通過作用于某一或某些離子通道，參與調控胞內的鈣離子梯度的正常建立與維持。

研究顯示CBL1的N末端存在肉豆蔻酰化和棕櫚酰化修飾位點，這兩類脂質修飾一方面可以影響CBL1蛋白到內質網的途徑，另一方面也可以妨礙內質網經由囊泡體系到頂端質膜的過程［21］。對CBL1的N末端保守位點進行修改，能夠有效阻斷這兩種脂質修飾，以此獲得CBL1的點突變體（CBL1G2A，第二位的甘氨酸定點突變為丙氨酸）。CBL1G2A無法正常定位到質膜上，呈現彌散分布［18］。CBL9與CBL1的序列相似度超過89%，本研究采取了CBL9相似研究策略，并取得了相同的結果，即CBL9的N端保守位點的改變直接影響其正常的花粉管質膜定位和功能發揮。CBL9定位異常的原因可能是由于其N-末端無法有效肉豆蔻酰化和棕櫚酰化，從而影響了CBL9借助囊泡體系定位到花粉管質膜的過程。

除了花粉管極性生長方面，序列高度相似的CBL1與CBL9的相關進展主要體現在植物脅迫條件下的應激反應。例如低鉀條件下，CBL1與CBL9共同激活下游互作靶蛋白CIPK23，具備蛋白激酶活性的CIPK23再進一步激活質膜定位的鉀離子通道AKT1，從而提高了植株根系吸收鉀離子的能力。另外CBL1/9-CIPK23體系還可以通過磷酸化作用，激活硝酸鹽轉運載體CHL1以應對低氮脅迫［13］。盡管CBL1與CBL9在很多方面都體現出相似的生物學功能，但兩者的組織定位表現出明顯的差異。CBL1主要在葉及根中表達，而CBL9則相對集中于花粉中（圖1）。由此推測CBL1可能主要在脅迫應答方面發揮作用，而CBL9可能主要調控花粉管的極性發育。

本研究中CBL9作為鈣離子感受器的一種類型，在花粉管的質膜上呈現均勻分布狀態，說明CBL9功能并不局限于一個特定的質膜區域，而是可以在整個花粉管發揮它的功能。處于生長狀態的花粉管中存在一個從頂端向下延展的鈣離子濃度梯度（2-10 μmol/L），鈣離子感受器CBL9作為分子開關的活性高低，可能取決于鈣離子在花粉管中不同質膜區域的濃度。CBL下游存在一類蛋白激酶（CIPK），逆境脅迫研究揭示了一個錯綜復雜的CBL-CIPK互作的網絡系統：不同脅迫條件（鹽害、低溫等）誘導的鈣信號被不同的CBLs所感知，然后作用于不同的CIPKs，最終將逆境誘導產生的鈣信號按照不同方式傳遞下去，以完成植物不同的生理活動需要。另外，一個CBL蛋白與不同CIPKs相互作用時可以顯示不同鈣離子濃度的依賴性［3，13，22］。花粉管極性生長過程中可能存在類似的調控體系：花粉管不同區域內的不同鈣離子濃度被CBL9感應，進而分別作用于下游不同的CIPKs，最終實現對花粉管頂端生長的多方面調控功能。花粉管頂端生長中的CBL-CIPK調控體系的建立，還有待CBL下游互作因子的進一步發掘。

4 結論

CBL9主要定位于花粉管的質膜，其過量表達造成花粉管的去極化生長，而N末端點突變體CBL9G2A無法定位到質膜，并呈現正常的花粉管頂端生長表型。CBL9的N末端在其亞細胞定位及功能發揮方面發揮一定的作用。