Dof轉錄因子在植物中的調控作用

郭彥秀 陳靜，2 王艷芳，3 孫春玉，2 王義，2 張美萍，2

（1. 吉林農業大學生命科學學院，長春 130118；2. 吉林省人參基因資源開發與利用工程研究中心，長春 130118：3. 吉林農業大學中藥材學院，長春 130118）

DNA binding with one finger（Dof）屬于鋅指蛋白家族中的一類亞家族，是植物中特有的一類轉錄因子，在酵母和線蟲中尚未發現有Dof蛋白的存在［1］。由于Dof轉錄因子是植物特有、而且是一個較大的基因亞家族，其結構和功能具有多樣性，是研究轉錄因子結構與進化理想的材料。本文重點綜述Dof轉錄因子亞家族成員的結構、進化及在植物中的調控作用，以期對Dof轉錄因子深入研究奠定基礎。

1 Dof轉錄因子在植物中的數量

1993年，在玉米中首次發現了Dof轉錄因子，命名為ZmDof1（MNB1）［2］。截至目前，從簡單的綠色單細胞藻類到復雜的高等植物都有Dof轉錄因子的報道（表1）。

表1 Dof轉錄因子在植物不同物種中的數量

2 Dof轉錄因子的結構特征

Dof轉錄因子一般由200-400個氨基酸組成，除了寡聚化位點和核定位信號外還具有兩個功能結構域［24］：（1）位于N-末端的 DNA 結合區。在該區內具有一個富含半胱氨酸（Cysteine，Cys）殘基的單鋅指保守結構域［25］（圖1），此結構域由52個氨基酸組成，其中包含4個保守的Cys殘基和一個Zn2+，它們通過共價結合形成CX2CX21CX2C基序（Motif）（圖2）［1］。該基序中4個半胱氨酸任何一個發生突變，都會影響鋅指結構使其不能與DNA結合，導致Dof轉錄因子活性喪失［26］。（2）位于C-末端的轉錄調控區。該區由一個色氨酸的單鋅指保守結構域組成，其穩定性對DNA結合也非常重要。Dof轉錄因子的核心識別位點是AAAG序列（或它的互補序列，CTTT）［27-29］，但南瓜的識別位點是 AAGT 序列［30］。Dof核心識別位點兩側序列不僅可以與DNA相互作用，也可與蛋白質相互作用，是雙重功能區域。如擬南芥的Dof蛋白OBP1（OBF binding protein）可以通過該功能區域促進OBF4（Ocs element binding factor）與病原菌特異元件OCS（Octopine synthase）的結合［31］。在玉米中，Dof蛋白PBF（Prolamin-box binding factor）也可以通過該功能區域介導Dof與bZIP蛋白O2（Opaque 2）相互作用［32］。這些相互作用可能是Dof轉錄因子具有多種功能的因素［33］。

3 Dof轉錄因子的進化

進行Dof轉錄因子系統分類研究不僅可以揭示Dof轉錄因子的起源與進化，還可以揭示它們相似的結構和進化關系，提供基因功能信息。因此，進化分析對基因的的結構和功能研究具有重要意義。

Yanagisawa等［34］對擬南芥中的 36個 Dof轉錄因子進行了進化分析，根據它們的蛋白序列將這些Dof轉錄因子分成了7個組。這7個組除了高度保守的Dof結構域外還存在其他的保守基序。從進化樹上看蛋白結構相似并且高度同源的Dof轉錄因子形成一簇（Cluster），如DAG1（Dof affecting germination，AtDof3.7） 和DAG2（Dof affecting germination，AtDof2.5），但是它們的功能相反，DAG1抑制種子萌發，DAG2促進種子萌發［35-38］。這些研究說明結構相似的基因，其功能有可能不同。因此用進化樹鄰近同一簇的基因做未知基因功能預測時，有可能得不到理想的結果。

Moreno-Risueno等［4］對擬南芥、水稻、大麥、綠藻、苔蘚和裸子植物等6個物種的116個Dof轉錄因子進行了系統分類。結果這些Dof轉錄因子分成了7個組，分別是A、B、C、D、E、F和G，其結果與Yanagisawa的研究結果相似。Moreno-Risueno等又進一步分析了Dof轉錄因子的保守氨基酸序列，結果顯示各組內具有相似的保守氨基酸序列，并且部分氨基酸序列在各組內高度保守，說明組內的基因在功能上有可能相似。內含子分析結果表明：A、F和G組含有內含子，而B、C和E組中沒有內含子，D組中有2個基因（HvDof3和OsDof17）有內含子。綠藻CrDof1有4個內含子，其中有2個內含子是綠藻特有的。這些研究說明Dof轉錄因子的內含子隨著植物的進化而逐漸減少或丟失。

由前人的結果筆者總結了36條擬南芥Dof蛋白的motif與進化樹（圖3），找到motif共計5個，根據Yanagisawa等構建進化樹的結果將36條蛋白序列分為7個組，與Yanagisawa等不同的結果是第6組和第7組串在第5組之間。進化樹與Motif的組合圖進一步說明了各組內具有相似的保守氨基酸序列，與Moreno-Risueno等結果一致。

圖1 Dof轉錄因子典型特征與鋅指結構相關的4個半胱氨酸殘基

圖2 Dof蛋白結構域模式圖（A）［25］和ZmDof1全序列結構示意圖（B）［1］

4 Dof轉錄因子在植物中的調控作用

Dof轉錄因子在許多生理生化反應中起著關鍵的調控作用并且其功能多樣化。尤其在種子發育、組織分化和代謝調控方面起著非常重要的調控作用（圖 4）［39］。

4.1 種子發育

圖3 擬南芥Dof蛋白的保守氨基酸序列及進化關系（參考［34］修改）

赤霉素作為一種重要的植物激素，它能夠調控種子的萌發，經研究證明一定量的赤霉素可以促進種子的萌發，而Dof轉錄因子通過調控赤霉素的生物合成實現對種子萌發的影響。有研究證明，控制擬南芥種子萌發的基因為DAG1（Dof affecting germination，AtDof3.7），該基因在脈管系統中特異表達，Papi等［35］在T-DNA插入突變體DAG1，結果發現種子一直保持休眠狀態，不能在黑暗中萌發。Gabriele等［36］發現DAG1基因位于主阻遏子PIL5的下游，通過直接抑制GA3ox1基因的生物合成從而減少赤霉素的含量，抑制了種子的萌發，證明了在種子光誘導的萌發過程DAG1基因中是一個阻遏子。Gualberti等［37］又在擬南芥中發現一個與DAG1高度同源并具有相似結構特征的基因，將其命名為DAG2基因。DAG2基因的表達受到環境因素的影響，并且PIL5和DAG1可以抑制該基因的表達［38］。在大麥中，種子萌發的過程依賴激活組織蛋白酶基因，位于糊粉層中的Dof轉錄因子SAD通過激活該基因的表達促進種子的萌發，而另外一個轉錄因子BPBF卻能抑制種子的萌發，其功能是通過抑制組織蛋白酶基因的表達而實現的［40］。此外，BPBF對于Amy32b基因（α-淀粉酶的功能基因）的調節過程與對組織蛋白酶基因的調節過程相似，Amy32b基因在種子發育階段被抑制，但是在種子萌發階段被激活［41］。擬南芥中的Dof轉錄因子AtDof6（AtDof3.2）基因能與TCP14蛋白相互作用，促進種子的萌發［42］。水稻中的Dof轉錄因子OsDof3同樣可以促進種子的萌發，該轉錄因子在赤霉素的作用下可以與CPD3（type3羧肽酶）基因啟動子的AAAG序列結合，激活該基因的表達，促進種子的萌發［43］。

圖4 Dof轉錄因子參加的主要的植物生物過程［39］

有些Dof蛋白不僅能夠調節貯藏蛋白的合成，還參與其他蛋白的表達。在水稻中，OsDof24和OsDof25能夠調節谷蛋白GluB-1基因的表達，該蛋白屬于種子貯藏蛋白［44］。有一些學者將某些Dof轉錄因子命名為PBFs，如玉米PBF、水稻RPBF、小麥WPBF、大麥BPBF，他們能夠特異識別醇溶蛋白基因（胚乳表達基因）啟動子上的TGTAAAG序列，從而激活其表達。如大麥的Dof基因BPBF能反式激活大麥胚乳醇溶蛋白基因hordein的表達。Mena等［45］在小麥中克隆到Dof家族基因小麥醇溶-谷蛋白盒結合因子（Wheat prolamin-box binding factor，WPBF），該基因在胚乳中特異表達，能激活醇溶蛋白的表達；Dong等［46］研究表明WPBF與TaQM基因相互作用，參與小麥胚乳特異α-醇溶蛋白基因的表達調控；玉米的Dof蛋白PBF可以和胚乳特異表達玉米醇溶蛋白基因的啟動子結合并激活其表達，從而調控玉米胚乳蛋白含量，影響種子的粒重和品質。研究表明PBFs還能夠與Opaque-2（bZIPs轉錄因子）相互作用，并且PBFs在種子的發育階段能夠激活醇溶蛋白基因的表達［47］。PBFs和Opaque-2兩個基因除了能調節醇溶蛋白基因以外，還可以調節其他的胚乳表達基因，如賴氨酸-酮戊二酸還原酶基因LKR，該基因的表達需要PBF和Opaque-2兩個轉錄因子共同作用，而醇溶蛋白基因的表達只需要其中一個轉錄因子［48］。以上研究說明Dof轉錄因子對于植物種子的萌發和發育有著重要作用。

4.2 組織分化

在擬南芥中AtDof4.2能調控植物的分支發育，這種調控機制是AtDof4.2能與AtEXPA9啟動區結合從而調控AtEXPA9基因的表達來參與植物分支發育的［49］。在擬南芥中REV基因能夠建立葉片遠—近軸面極性，AtDof5.1基因可與REV基因的啟動子區域結合，激活REV基因的表達，影響極性分化使葉片向上卷曲［50］。AtDof2.4和AtDof5.8能調控維管束的發育，其啟動子分別在維管束形成初期的不同階段發揮功能，AtDof2.4在形成層細胞中表達，而AtDof5.8在葉脈和花蕾的維管組織中表達［51］。ZmD-of1通過負調控Zm401基因控制玉米的花粉發育［52］。

Dof轉錄因子可參與植物對激素應答基因的表達調控和對生長調節物質的響應過程，Dof轉錄因子NtBBF1（rolB domain B factor 1）能夠特異性的結合到癌基因rolB啟動子的ACTTTA基序，從而調控該基因在頂端分生組織和微管組織中的特異性表達和生長素誘導表達，促進根的生長［53-54］。在生長素誘導的條件下，Dof蛋白可以結合到南瓜抗壞血酸鹽氧化酶基因（Ascorbate oxidase promoter-binding protein，AOBP）的啟動子上，抑制該基因在生長組織中的表達［30］。生長素也可以調控擬南芥中OBP3（AtDof3.6）的表達，在過表達該基因后，發現其能夠促進擬南芥的生長。在煙草中過表達Dof轉錄因子GmDof17-1基因，煙草的生長緩慢［55］。

Dof轉錄因子還可以保衛植物細胞的發育，在馬鈴薯中，StDof1可以激活與保衛細胞K+流通道蛋白調控的關鍵基因KST1基因，使其在保衛細胞中特異表達，從而調控保衛細胞對CO2的吸收和水分的擴散［56］。擬南芥中SCAP1基因在成熟的保衛細胞中表達，調控與氣孔發育相關基因的表達，如K+通道蛋白、MYB轉錄因子、果膠甲酯酶等編碼基因［57］。擬南芥中Dof轉錄因子OBP1（OBP-binding factor-1）參與細胞周期的調控。OBP1與Dof轉錄因子的另一個基因AtDof2.3共同作用可以調控周期蛋白基因CYCD3，使細胞周期縮短，但同時也減少了細胞總分裂數。在擬南芥中過表達OBP1會導致植株矮小［58］。擬南芥中的AtCDFs（Cycling Dof factor），它能夠參與光周期反應調控過程，其中AtCDF1能夠結合到成花因子FLOWERING LOCUS T（FT）的調控因子CONSTANS（CO）的啟動子區域，抑制CO的表達，進而抑制FT的表達，最終抑制擬南芥的開花。AtCDF1是FKF1（Flavin-binding，Kelchrepeat，F-box-1）的靶基因，FKF1能夠通過泛素依賴的途徑抑制光反應，因此CDF1與開花響應過程有密切的關系［59］。在馬鈴薯中發現的Dof基因與CDF具有高度的同源性，研究表明它能夠調控馬鈴薯塊莖的發育。有報道稱，在擬南芥中過表達番茄Dof轉錄因子SlCDF3，它能通過調節成花基因如CO和FT推遲開花［60］。擬南芥中AtDof4.1作為一個轉錄阻遏子也能夠延遲開花，抑制生殖器官發育，并且能夠使葉片、花和角果等器官變小［61］。AtDof4.7在植物的離區（Abscission zone）中高度表達，抑制了對花器官脫落非常重要的多聚半乳糖醛酸酶基因PGAZAT的表達。研究表明，AtDof4.7能夠與AtZFP2（鋅指類轉錄因子）相互作用，該轉錄因子也抑制了花器官的脫落，這兩個轉錄因子具有協同作用［62］。水稻Dof轉錄因子OsDof12能通過調控Hd3a和OsMADS14的表達來調節水稻的開花機制［63］。以上研究結果表明，Dof轉錄因子在花粉發育，葉片極性，維管系統發育，保衛細胞發育，花器官的脫落及開花響應等生理過程中具有重要作用。

4.3 Dof轉錄因子在初級代謝中的調控作用

在碳代謝過程中，Dof轉錄因子調控其相關基因的表達。在玉米中ZmDof1能夠結合OsCS4PPDK啟動區的AAAG基序使細胞質中的C4磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和丙酮酸激酶基因的表達提高，但是ZmDof2抑制C4磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的表達［64］。研究發現：將ZmDof1的轉錄水平降低到原來的80%，玉米中C4途徑特異性基因的表達也不會受到影響［65］。在獼猴桃中，AdBAM3L基因是Dof轉錄因子AdDof3的靶基因，AdBAM3L基因控制該水果在成熟過程中淀粉降解成單糖的過程，可提高甜度及口感［66］。在甘薯中，根中的SRF1基因超量表達時可顯著降低Ibβfruct2基因的轉錄水平從而使蔗糖轉化酶的積累量降低，并導致了單糖的濃度減少，增加了塊莖中淀粉含量，從而調控了碳代謝［67］。Dof蛋白不僅可以調控碳代謝還可以提高植物的氮利用率增加氮含量。在擬南芥中過表達ZmDof1基因后，陽性植株氮含量增加，能夠在低氮條件下良好生長，同樣，ZmDof1轉基因水稻在低氮條件下也生長良好，證明了ZmDof1基因在氮代謝中的作用［39，68］。在擬南芥中超量表達OsDof25基因，促進了高親和、低親和銨轉運蛋白基因AtAMT1.1和AtAMT2.1的表達抑制了高親和硝酸鹽轉運蛋白基因AtNRT2.1的表達，結果總的氨基氮含量提高，丙酮酸激酶（PK1和PK2），磷酸烯醇丙酮酸羧基酶（PEPC1、PEPC2）及NADP依賴的和NAD依賴的異檸檬酸脫氫酶基因的表達量增加。同時，谷氨酸脫氫酶活性增強，導致總氨基酸含量增加［69］。以上研究結果表明，無論是碳代謝還是氮代謝，Dof轉錄因子都起著至關重要的作用。

4.4 Dof轉錄因子在次生代謝中的調控作用

Dof轉錄因子還參與植物次生代謝產物的合成。在擬南芥中，Dof轉錄因子與苯基丙酸合成途徑和類黃酮合成途徑兩個次生代謝過程有關。據Skirycz的研究報道，超量表達AtDof4.2可以增加植株在低溫下對光的敏感性，從側面反映了AtDof4.2能夠影響芥子酸酯和黃酮醇的變化。在正常條件下，轉基因植株中黃酮醇沒有發生顯著變化，但是將其轉移到4℃或者強光下，植物中積累的黃酮醇會越來越少，說明在低溫和強光下，AtDof4.2可以負調控黃酮類物質的合成。之后該作者又在苯基丙酸合成途徑中發現AtDof4.2可以正調控肉桂酸的合成［49］。

Dof轉錄因子還可以調控油脂的合成，并控制脂肪酸的含量。擬南芥中超表達的OBP2可通過增加P450基因（CYP83B1）的表達調控吲哚芥子油的生物合成［49］。Tian等［70］從大豆中鑒定出了28個Dof轉錄因子，其中GmDof4和GmDof11基因在油脂合成過程中起著重要作用。GmDof4和GmDof11基因產物分別特異性結合到乙酰輔酶A羧化酶基因（Acetyl CoA carboxylase）和長鏈脂酰輔酶A合成酶（Long-chain-CoA synthase）基因的啟動子上，激活這兩個基因的表達。乙酰輔酶A羧化酶和長鏈脂酰輔酶A合成酶是油脂合成過程的兩個關鍵酶。在大豆中超表達GmDof11，可以提高大豆種子的含油量，降低蛋白質的含量，但對各脂肪酸組成沒有顯著影響［71］。在擬南芥中，超量表達GmDof4和GmDof11后，轉基因株系種子的總油脂含量和油酸含量與野生型相比都顯著提高，而種子貯藏蛋白基因CRA1的表達下調［72］。在橢圓小球藻（Chlorella ellipsoidea）中超量表達GmDof4基因后，細胞中油脂含量提高了44.4%-52.9%［73］。在油菜中干擾BnDof5.6基因的表達，后代種子胚變小，油分含量降低。轉錄組分析表明，干擾BnDof5.6基因的表達影響脂肪酸的合成和脂肪酸去飽和酶相關基因的表達［74］。

5 問題與展望

Dof轉錄因子廣泛參與植物種子發育和萌發、組織分化和代謝過程，這說明了Dof轉錄因子在植物的生長發育起著關鍵的作用。到目前為止，有關Dof轉錄因子的研究主要集中在模式植物和主要農作物中，如擬南芥、大豆和玉米等，但在藥用植物中的研究少之甚少。研究領域主要集中在植物的發育及組織分化上，在次生代謝物合成中的作用僅報道了脂肪酸和類黃酮，其他的次生代謝物如甾醇類化合物并沒有相關報道。該轉錄因子的靶基因尚不明確，與其他轉錄因子或蛋白的相互作用機制尚不清楚，對植物代謝調控機制還需要進一步研究。近幾年隨著基因組測序的陸續完成，Dof轉錄因子也依次在其他植物中被挖掘。因此，在今后的研究中可以在藥用植物中挖掘轉錄因子并預測其功能，并利用生物技術手段將克隆到的基因轉化到藥用植物中，用以研究Dof轉錄因子調控的次生代謝合成，這將有助于提高具有藥理活性的次生代謝產物的合成并闡明合成的分子機理及互作網絡機制。