DrwH類信號肽序列對其抗氧化功能的影響

郭磊周 韓佳慧 唐殷 李江， 黃程 代其林 王勁 平淑珍江世杰

（1. 西南科技大學生命科學與工程學院，綿陽 621010；2. 中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081）

異常球菌屬細菌是地球上迄今為止發現的最具輻射抗性的微生物，其中耐輻射異常球菌（Deinococcus radiodurans）R1是 1956年首次被鑒定的異常球菌屬菌株，該菌對多種非生物脅迫具有超強的抵抗能力，包括γ-輻射、UV輻射、干燥、高溫以及氧化等［1-3］。在耐輻射異常球菌中存在dr1372（命名為drwH）基因位點，其編碼產物屬于植物干燥抗性相關的胚胎發育晚期豐富蛋白（LEA）第5C家族成員［1，4-5］。LEA5C蛋白具有較高疏水性、較低序列重復性、不穩定系數及小分子氨基酸含量低、熱穩定性差等特性，因此是一類非典型LEA蛋白［6-8］。值得注意的是，幾乎所有已發現的LEA5C蛋白都包含一個“水脅迫和超敏反應結構域（Water stress and hypersensitive response，WHy）”，該結構域與生物體耐受干旱等非生物脅迫密切相關［9］。

到目前為止，有關細菌WHy蛋白的實驗性研究僅有兩個，即耐輻射異常球菌DrwH蛋白［5］和來源于南極沙漠土壤宏基因組文庫的dWHy1蛋白［10］。研究報道，dWHy1蛋白N端含有26個氨基酸組成的信號肽序列，完整野生型dWHy1蛋白在大腸桿菌中異源表達，其存活率高于只含有空載體的對照菌株；而缺失信號肽的截短蛋白dWHy1ΔSP能顯著增強宿主細胞耐受冷凍脅迫的能力［10］。本研究前期對來源于耐輻射異常球菌的DrwH核心結構域蛋白Dr-WHy在大腸桿菌中的抗逆功能進行初步研究，其在大腸桿菌中表達能夠增強宿主的氧化脅迫抗性。此外，氧化脅迫（H2O2）條件下，Dr-WHy蛋白對蘋果酸脫氫酶（MDH）和乳酸脫氫酶（LDH）的酶活性有保護作用［5］。DrwH從耐輻射異常球菌中發現，對其非生物脅迫條件下功能的研究顯得尤為重要。

大量來源于植物或微生物的LEA/WHy蛋白都是以大腸桿菌為底盤生物進行研究［11-12］。Liu等［13］采用分段截短及人工合成的方法研究來源于大豆的LEA3家族蛋白PM2的抗逆功能區域，確定了22-mer的重復序列在PM2蛋白增強大腸桿菌耐受高鹽脅迫過程中起主要作用。Zou等［14］通過類似的分段截短方法對大豆LEA1家族蛋白Em進行分析，分別構建了N末端區域（Em-N）、中間區域（Em-2M）及C末端區域（Em-C）的截短蛋白，研究證明了在體外冷凍脅迫條件下不同結構域對LDH的保護能力（Em-C ＞Em-2M ＞Em-N）。盡管前期已對 DrwH 蛋白進行了初步研究，但其一級結構上某些特征序列是否具有類似于dWHy1中信號肽的功能，對核心結構域蛋白WHy的表達產生影響值得探討。本研究以大腸桿菌為宿主菌株，比較分析drwH基因不同區域構建的重組菌株抗氧化能力的強弱，進一步揭示DrwH類信號肽序列對其抗氧化功能的影響。DrwH類信號肽功能的初步研究，將為進一步探索耐輻射異常球菌的氧化脅迫抗性分子機制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒與培養條件 本研究所需要的菌株與質粒如表1所示。大腸桿菌于LB培養基（Tryptone 10 g/L，Yeast Extract 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0，固體培養基中加入agar 15 g/L）中37℃條件培養。含外源質粒的重組大腸桿菌，培養過程中加入相應的抗生素（如Kan 50 μg/mL）。

1.1.2 主要試劑 常規PCR反應試劑（PrimeSTAR HS DNA polymerase、dNTPs、Ex Taq酶）購自TaKa-Ra公司；限制性核酸內切酶、T4 DNA連接酶等購自NEB公司；細菌DNA提取試劑盒、質粒小量快速抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒均購自Magen公司；細菌RNA提取試劑盒購自Promega公司；30% H2O2，所用其他試劑均為分析純。引物合成與測序均由華大基因公司完成。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析 使用SignalP 4.1、Phobius等在線軟件進行蛋白信號肽預測分析。

1.2.2 重組大腸桿菌構建 本研究采用常規PCR克隆、酶切、連接、轉化方法構建重組大腸桿菌菌株，將目的基因連接于pET28a表達載體，轉化E. coliBL21（DE3）獲得重組菌株。具體方法參照文獻［5］。重組質粒構建所需引物如表2所示，SP-WHy基因由金唯智生物科技公司合成。

1.2.3 重組大腸桿菌抗氧化脅迫實驗 將實驗菌株在LB平板（50 μg/mL Kan）上分別劃線過夜培養，從活化的平板上分別挑取單菌落于3 mL 新鮮液體培養基（50 μg/mL Kan）中37℃過夜培養，按初始OD600為0.05分別接種于20 mL的新鮮LB液體（50 μg/mL Kan）培養基中，培養30 min后加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG于培養基中，連續培養至菌液OD600約為0.5，分別取出1 mL進行氧化脅迫處理。向上述1 mL菌液中加入15 mmol/L H2O2，處理10 min后立即10倍梯度稀釋（10-1-10-4），每個稀釋梯度各取10 μL點在LB固體培養基表面，經37℃恒溫培養16 h后觀察菌落形成情況。

表2 本研究所用引物列表

1.2.4 重組大腸桿菌生長曲線測定 從過夜培養的平板上挑取重組菌株BL21-DrwH、BL21-WHy及對照菌株BL21-pET單菌落，接種于新鮮的20 mL LB液體培養基中（50 μg/mL Kan），37℃、220 r/min過夜培養。按初始OD600為0.05分別將種子液接種于50 mL新鮮LB液體培養基中（每個樣品3個重復），37℃、220 r/min搖床培養，每隔1 h取樣，測定OD600值，連續測定至細菌生長穩定期。分別以培養時間和OD600吸光值為橫縱坐標，繪制菌株的生長曲線。

1.2.5 qRT-PCR分析基因轉錄水平 接種活化的BL21-DrwH、BL21-WHy菌株于新鮮的20 mL LB液體培養基中，37℃、220 r/min搖床培養30 min后加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG于培養基中（對照不加IPTG），連續培養至菌液OD600約為0.5，離心收集菌體，使用Promega RNA試劑盒提取菌體總RNA，并反轉錄為cDNA，通過qRT-PCR分析基因的表達水平。每個實驗3次重復，取平均值。

2 結果

2.1 DrwH蛋白信號肽預測分析

耐輻射異常球菌基因組數據分析顯示，drwH基因位于耐輻射異常球菌R1基因組Ⅰ號染色體上，該基因全長495 bp，編碼164個氨基酸。通過SignalP 4.1和Phobius在線軟件對蛋白信號肽進行預測顯示（圖1），DrwH蛋白的N端含有19個氨基酸組成的信號肽類似序列，該類信號肽序列組成一個α螺旋結構。

使用DNAMAN對來自植物、細菌和古細菌的48種LEA5C家族蛋白序列比較分析，結果顯示耐輻射異常球菌DrwH蛋白的WHy結構域與Deinococcus屬同源蛋白的WHy序列一致性最高（41.9%-61.6%），而與其他物種來源的WHy序列一致性僅為20%左右。同時對這48種LEA5C家族蛋白進行信號肽預測，發現有18種蛋白存在預測的信號肽，其中所有Deinococcus屬來源的蛋白中都存在預測的信號肽序列（11個），所有細菌和部分古細菌中總共有7個含有預測的信號肽，而植物來源的LEA5C蛋白中均不含預測的信號肽（表3）。

圖1 采用SignalP 4.1和Phobius軟件預測DrwH信號肽

2.2 重組大腸桿菌的構建

根據信號肽和結構域預測顯示，DrwH蛋白N端含有19個氨基酸組成的類信號肽和一個WHy核心結構域，因此對DrwH蛋白的不同結構區域進行分段研究（圖3-A），分別構建了野生型全長蛋白DrwH、C端截短蛋白DrwHΔC、N端截短蛋白DrwHΔN、核心結構域蛋白WHy、類信號肽SP、類信號肽SP缺失蛋白DrwHΔSP及類信號肽與WHy的重組蛋白SP-WHy，對其編碼基因片段通過BamHI/HindIII雙酶切消化后，分別連接于pET28a質粒，獲得重組載體，轉化E. coliBL21（DE3），構建的重組菌株分別命名為BL21-DrwH、BL21-DrwHΔC、BL21-DrwHΔN、BL21-WHy、BL21-SP、BL21-DrwHΔSP和BL21-SP-WHy（表1），重組菌株的構建策略如圖2-A所示，重組載體通過PCR、酶切及測序驗證正確（圖2-B顯示28a-drwH和28a-WHy的驗證結果）。

2.3 氧化脅迫抗性分析

為探索DrwH蛋白不同區域對其抗氧化功能的影響，本研究對構建的BL21-DrwH、BL21-DrwHΔC、BL21-DrwHΔN、BL21-WHy重組大腸桿菌菌株和BL21-pET對照菌株分別進行氧化脅迫處理（圖3-B）。結果顯示，15 mmol/L H2O2脅迫處理10 min后，表達截短蛋白DrwHΔN和結構域蛋白WHy的重組菌株與對照菌株BL21-pET相比，存活能力提高了近3個數量級，而表達全長蛋白DrwH和截短蛋白DrwHΔC的重組菌株在H2O2處理后生存能力與對照菌株都對氧化沖擊極為敏感。值得注意的是，在未脅迫處理的實驗組，表達DrwH和DrwHΔC蛋白的重組菌株生存能力與其他菌株相差至少一個數量級，而這兩種菌株均含有類信號肽序列SP。

結合生物信息學預測結果分析，由于全長蛋白DrwH和截短蛋白DrwHΔC的N端都含有19個氨基酸的類信號肽，為進一步驗證類信號肽與大腸桿菌生長受抑制之間的關系，本研究構建了BL21-SP、BL21-DrwHΔSP及BL21-SP-WHy（圖3）。對構建的重組大腸桿菌菌株進行15 mmol/L H2O2沖擊10 min，結果顯示，只要含有類信號肽SP重組蛋白的菌株，生長能力均受到不同程度抑制，表明DrwH蛋白的N端19個氨基酸組成的類信號肽序列是影響重組大腸桿菌生長的主要原因。此外，進一步表明DrwH發揮抗氧化功能的主要區段是核心結構域WHy。

2.4 重組菌株生長曲線測定

通過在正常培養條件下（LB培養基），測定重組菌株BL21-DrwH、BL21-WHy及對照菌株BL21-pET的生長曲線，進一步分析類信號肽SP對重組蛋白的影響。結果顯示，所有的實驗菌株在0-2 h生

長時期沒有變化，隨著培養時間的延長，OD600大于0.5時，表達結構域蛋白WHy的BL21-WHy與對照菌株沒有明顯差異，而過量表達全長蛋白DrwH的BL21-DrwH菌株生長明顯受到抑制，最大OD600僅為0.8左右（圖4）。實驗結果表明在大腸桿菌中只要表達包含N端35個氨基酸（其中含有類信號肽序列SP）的重組蛋白，就會影響大腸桿菌菌株的正常生長。

表3 LEA5C家族蛋白信號肽預測分析

圖2 重組大腸桿菌構建（A）與驗證（B）

圖3 表達DrwH不同截短蛋白重組菌株的抗氧表型分析

圖4 過量表達全長DrwH和核心結構域WHy蛋白的重組大腸桿菌生長曲線

2.5 蛋白表達量對重組菌株抗氧化能力的影響

此外，本研究對未誘導（未添加IPTG）的重組菌株BL21-DrwH、BL21-WHy及對照菌株BL21-pET使用15 mmol/L H2O2處理10 min，結果顯示，氧化脅迫處理后菌株生長能力均下降3個數量級，且所有菌株在正常培養和脅迫處理條件下均無差異，對氧化脅迫的抵抗能力也沒有差別（圖5-A），表明蛋白的表達量對重組大腸桿菌菌株的生長及抗氧化能力有顯著的影響，細胞中蛋白量累積到一定水平才能發揮生物學功能，同時也證明了類信號肽SP的毒性效應也是在蛋白過量積累后出現的。通過qRTPCR分析了全長DrwH和核心結構域WHy編碼基因在mRNA水平上的表達量（圖5-B），結果顯示經0.1 mmol/L IPTG誘導后，drwH和WHy基因的mRNA表達量比未經IPTG誘導的表達量均顯著上調。以上結果表明，DrwH和WHy蛋白的表達量積累到較高水平才能發揮功能，同時也說明核心結構域N端的類信號肽序列SP對細菌的生長有影響。

圖5 蛋白表達量對重組菌株抗氧化能力的影響

3 討論

本研究對耐輻射異常球菌DrwH蛋白信號肽預測分析發現，該蛋白N端含有19個氨基酸組成的信號肽序列，基于細菌中存在信號肽的說法目前還有待考證，本研究提出類信號肽序列SP的命名。通過對DrwH蛋白分段截短并構建含有不同區段的重組大腸桿菌，比較分析重組菌株在正常培養和氧化脅迫下的生長能力，發現含有類信號肽序列SP的全長DrwH蛋白過量表達對大腸桿菌的生長具有明顯抑制作用，類似于一種毒性效應，這與Anderson等［10］對dWHy1信號肽的研究結果一致。利用qRTPCR分析重組菌株BL21-DrwH中drwH基因轉錄水平的變化發現，與未誘導的對照菌株相比，其表達量上調近70倍，表明drwH基因在mRNA水平受誘導。因此我們推測，DrwH在蛋白水平過量積累會對宿主細胞產生毒性，抑制其生長。

預測分析顯示植物來源的LEA5C家族蛋白均不含信號肽序列，古細菌中也只有少數幾個蛋白存在，而在所有的細菌LEA5C蛋白中都包含19-29個氨基酸組成的類信號肽，相比植物龐大的基因組而言，類信號肽序列在細菌相對緊湊的基因組中存在更顯其重要性。研究顯示，幾乎所有LEA5C家族蛋白都含有WHy結構域，且WHy廣泛存在于植物中，在少數細菌和古細菌中也有發現［9］。這個零散的分布可能是由于進化過程中，微生物通過結構域的選擇性保留以應對脅迫環境而發揮功能［4］，或通過從植物到原核生物的水平轉移獲得［9］。結合WHy結構域進化的可能性，類信號肽在細菌和少數古菌LEA5C蛋白中存在，我們推測這些具有特殊功能的序列是在微生物進化過程中選擇性保留以應對環境脅迫［9］，而植物因其基因組龐大，結構復雜，在進化過程中并不需要這樣的類信號肽序列。另外，預測的19個氨基酸的短肽也可能作為調控序列，對細胞內DrwH蛋白的表達水平進行調節。根據以上分析，結合全長drwH基因突變導致耐輻射異常球菌對氧化和鹽脅迫極為敏感的現象，我們可以確定，在耐輻射異常球菌中必然存在一種DrwH蛋白的剪切機制，在轉錄水平或翻譯水平將未成熟蛋白加工修飾為成熟蛋白，從而發揮抗逆功能。

到目前為止，研究者對信號肽或類信號肽的存在與基因功能的相關性開展了一些研究。徐妙云等［15］對大豆24 kD油體蛋白基因在大腸桿菌中的表達研究表明，前22個氨基酸組成的信號肽可能影響了油體蛋白基因在細菌中的表達。Nguyen等［16］在P.pastorisX33中克隆了一個去除信號肽的內皮幾丁質酶基因mchit1，并使其表達分泌，發現信號肽缺失能夠提高酶的產率。Karlsson等［17］對革蘭氏陰性菌中TonB蛋白N端的信號肽序列研究表明，信號肽序列與蛋白TonB在內外膜之間的連接有關。彭蔚宇等［18］對雞白細胞介素10的信號肽體外表達分析發現，去除信號肽的重組質粒在胞漿中表達大量較強的綠色熒光，而含有信號肽的質粒熒光較弱且含量較少。Liu等［19］發現載脂蛋白M（apoM）未被切割的信號肽延緩了apoM向細胞外的轉運。Wang等［20］研究發現信號肽的優化可以提高1，4-β-甘露糖苷酶活性。同樣，本研究類信號肽序列過量表達對DrwH蛋白發揮功能產生不利影響，但對該類信號肽抑制DrwH蛋白發揮功能的分子機制仍不清楚。

4 結論

本研究分析顯示耐輻射異常球菌DrwH蛋白含有19個氨基酸組成的類信號肽序列，對DrwH蛋白進行分段截短及重新組裝，構建重組大腸桿菌菌株，并觀察不同菌株在正常培養及氧化脅迫條件下的生長情況。結果表明，含有類信號肽序列的融合蛋白過量表達不僅顯著抑制了大腸桿菌的生長，而且使WHy核心結構域失去抗氧化功能。qRT-PCR結果顯示含類信號肽全長蛋白DrwH和結構域蛋白WHy在轉錄水平大量累積，誘導表達實驗表明蛋白在過量積累條件下發揮其生物學功能。