煙草NtTkr尾部點突變對卷曲螺旋結構及與靶蛋白相互作用的影響

徐林娜 胡孟可 童文艷 李芬

（河南師范大學生命科學學院，新鄉 453000）

細胞內物質的定向運輸由分子馬達完成。驅動蛋白是一類非常重要的分子馬達，主要以二聚體形式存在，包括馬達頭部、莖部、連接頭部與莖部的頸鏈以及與“貨物”相結合的尾部4個部分［1］。已知的驅動蛋白種類繁多［2-4］功能多樣，不僅參與細胞內多種成分的定向運輸，對大腦發育、記憶功能提升及神經元活性等也非常重要［5-6］。驅動蛋白的諸多功能均與其卷曲螺旋結構密切相關。

卷曲螺旋結構（Coiled-coil，CC）存在于多種天然蛋白質中，典型的CC由兩股右手α螺旋鏈以左手螺旋形式相互纏繞而成，在該結構中氨基酸殘基（aa）每旋轉兩圈形成一個七肽單元重復序列，7個aa依次表示為 a、b、c、d、e、f、g，其中 a、d位多為非極性疏水氨基酸常特異性地位于卷曲螺旋的內側，e、g位多為極性帶電荷氨基酸常處在疏水核心的外側。這4個位置的氨基酸殘基對于整個卷曲螺旋結構的穩定性和特異性的維持非常重要［7-8］。

NtTkr是煙草驅動蛋白超家族新成員，異于絕大多數泛表達的植物驅動蛋白，僅在幼葉、發育各時期胚及其他分裂旺盛的組織中優勢表達，參與細胞周期調控，與胚、種子大小及萌發有關［9］。NtTkr尾部共有3個CC結構，CC1、CC2參與莖稈的形成，CC3識別并結合底物。本文通過卷曲螺旋結構分析和雙雜交檢測，探討了NtTkr 尾部CC3中T1084 缺失和替換突變對CC3結構和靶蛋白相互作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

AH109、Y187菌 株、 質 粒：pBI121-NtTkr、pGBKT7-NtTkrT大腸桿菌DH5α、pGBKT7、pGADT7等。

SD及缺陷培養基、X-α-Gal（Clontech 公司，美國）；KOD-plus高保真酶、dNTPs（2 mmol/L each）、10×KOD-plus buffer、25 mmol/L MgSO4（ToYoBo）；DNA markerλ-Eco T14、6×Loading buffer、限制性內切酶、T4DNA連接酶、DNA凝膠回收試劑盒（Takara，日本）；質粒提取試劑盒（TIANGEN，北京）；鮭魚精DNA（上海浩然生物技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 目的基因片段的擴增與檢測 缺失和替換突變采用兩對引物的3輪PCR來完成，兩端引物為：P1：5'-cccggggatggtccctgtggaagg-3'、P2：5'-ggatcctatg cgttcctggtaaatggc-3'；含突變位點的中間互補引物分別為 ：T1084A P3：5'-ctcaacttaaagacgctgctgaagctgttc-3'、P4：5'-gaacagcttcagcagcgtctttaagttgag-3'；T1084d P3：5'-ctcaacttaaagacgctgaagctgttc-3'、P4：5'-gaacagcttcagc gtctttaagttgag-3'；P1和P2兩端分別引入SmaI和BamHI酶切位點，以pBI121NtTkr為模板，分別以P1、P3；P2、P4及 P1、P3；P2、P4為引物分別進行PCR擴增，得到的產物凝膠回收后等摩爾混合，取適量作為模板，以P1、P2為引物擴增完整尾部片段。

1.2.2 誘餌表達質粒的構建和鑒定 凝膠電泳回收SmaI-BamHI線性化的pUC19和PCR產物進行連接并轉化DH5α感受態細胞，涂AMP+和x-gal 選擇平板。SmaI-BamHI雙酶切鑒定正確重組子并送去基因測序。將pGBKT7和測序正確的pUC19T1084d，pUC19T1084A分別進行SmaI-BamHI雙酶切，回收7.3 kb的pGBKT7載體和各PCR片段，連接并轉化DH5α感受態細胞，涂Kan+ 選擇平板，SmaI-BamHI雙酶切鑒定。

1.2.3 酵母感受態細胞的轉化 采用乙酸鋰轉化法［10-11］將 8 μL pGBKT7-NtTkrT/T1084d/T1084A 和pGADT7-H2A/Sulfer/NT3分別加入50 μL制備的吸光度值為0.4-0.5的AH109及Y187感受態細胞，SD/-Trp或SD/-Leu平板篩選轉化子。

1.2.4 重組質粒對酵母宿主的毒性作用與自激活驗證 按照Clontech操作說明，將重組質粒 pGBKT7-NtTkrT/T1084d/T1084A和空載體pGBKT7、pGADT7-H2A/Sulfer/NT3、pGADT7分別轉化感受態AH109和Y187，在SD/-Trp或SD/-Leu選擇平板上分別挑取直徑大于2 mm的各轉化子單克隆接種至缺陷培養基：SD/-Trp、SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-Ade、SD/-Trp-Ade/-His或 SD/-Leu、SD/-Leu/-His、SD/-Leu/-Ade以 及S D/-Leu/-Ade/-His，觀察生長情況并檢測自激活作用；同法選取上述轉化子接種于50mL的SD/-Trp/+Kan或SD/-Leu/+Kan（20 μg/mL）液體培養基中，30℃，250 r/min培養16 h，測定A600，檢測毒性作用。

1.2.5 酵母雙雜交鑒定 分別挑取直徑約2 mm的含pGBKT7-NtTkrT/T1084d/T1084A的AH109和含pGADT7-H2A/Sulfer/NT3的Y187克隆，共同接種于含0.5 mL YPDA培養液的1.5 mL離心管中，渦旋1min徹底打散混勻，30℃、30-50 r/min振蕩培養20-24 h后接種于SD/-Trp/-Leu平板，30℃倒置培養3-5d后挑取直徑約2 mm的二倍體單克隆于100 μL滅菌雙蒸水中混勻，取5 μL點樣于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/+X-α-Gal平板，30℃倒置5d，觀察結果。

1.2.6 T1084d、T1084A點突變對蛋白互作影響的檢測 挑取轉入T1084d、T1084A和野生（T）單菌落于適量培養基中，30℃、200 r/min過夜培養后，計數測其濃度，梯度稀釋后接種適量細胞數（1 000，2 000，400個）于配制好的SD-Ade/-Trp/-His/-Leu+xα-gal平板上，30℃培養3-5 d。

2 結果

2.1 T1084d和T1084A的獲得及克隆入pUC19后的鑒定

以pBI121NtTkr為模板PCR擴增1 kb和350 bp的T1083上下游片段（圖1-A）及兩片段搭接為模板PCR后獲得的T1084d、T1084A片段（圖1-B），與預期長度相符。將T1084d、T1084A克隆入pUC19經藍白斑篩選獲重組子進行SmaI-BamHI雙酶切鑒定得到了約1.32 kb的插入片段（圖1-C），與NtTkr尾部1 320 bp編碼區符合。測序結果顯示，編碼第1 084位蘇氨酸已經缺失或為丙氨酸替代。

2.2 T1084d、T1084A與BD融合誘餌表達質粒的構建和鑒定

將測序正確的pUC19-T1084d、pUC19-T1084A和pGBKT7質粒均用SmaI-BamHI雙酶切，回收1.32 kb的目的片段和7.3 kb的載體片段進行連接。轉化并篩選得到重組子再進行SmaI-BamHI的雙酶切鑒定，電泳結果（圖2-A）顯示得到了預期的片段，表明獲得了所需的T1084d和T1084A與BD融合誘餌表達質粒。

2.3 誘餌表達質粒和供試獵物質粒的自激活實驗和毒性檢測

分別轉化pGBKT7-NtTkrT/T1084d/T1084A和pGBKT7的AH109在SD/-Trp平板長出的單克隆（直徑＞1 mm）數量與分別轉化pGADT7-H2A/Sulfer/NT3和pGADT7的Y187在SD/-Leu 平板長出的單克隆（直徑＞1 mm）相似，均在45-50個之間；且含pGBKT7-NtTkrT/T1084d/T1084A 的 AH109（圖 3-A）和含 pGADT7-H2A/Sulfer/NT3 的Y187（圖3-B）分別只可在單缺培養基SD/-Trp和SD/-Leu上生長，在不含His的二缺培養基上 AH109菌株有輕微的自激活現象，但在加入強營養缺陷篩選標記Ade的二缺、三缺培養基上均不能生長，表明在AH109菌株中各質粒雖有His報告基因的泄漏表達，但不能激活強選擇性標記基因ADE表達。表明上述誘餌和供試靶蛋白可以在SD/-Trp/-Ade/-His/-Leu+X-α-gal 篩選條件下用于酵母雙雜交分析。上述各轉化株在含20 μg/mL Kan的液體培養基中，30℃、250 r/min培養16 h的A600均大于0.8，提示其對酵母生長無毒性，可用于酵母雙雜交檢測。

圖1 含T1084d和T1084A的獲得及克隆入pUC19后的鑒定

2.4 尾部兩種突變對卷曲螺旋結構及與靶蛋白相互作用的影響

Coiled-Coiled軟件分析表明NtTkr的T1084極性親水氨基酸蘇氨酸處于卷曲螺旋CC3的a位，將其替換為非極性的疏水氨基酸丙氨酸不僅增強HR結構域的疏水性，還造成了卷曲螺旋結構的增長，而T1084缺失則造成了卷曲螺旋結構的縮短（圖4-A）。上述兩突變誘餌與3個候選蛋白進行蛋白互作的雙雜交檢測（圖4-B）顯示T1084A與野生T的情況接近，但是先于T顯示藍色并深于T，T1084d則明顯不如T的情況，與H2A的接合株表現尤為明顯。表明將1 084位T替換為A，增強HR結構域的疏水性和七肽重復順序的長度造成NtTKrp與候選蛋白互作的增強，而缺失T1084位縮短卷曲螺旋的長度則造成其相互作用的減弱。且對于不同的靶蛋白上述突變對其相互作用影響程度不同。

圖2 誘餌表達質粒pGBKT7-T1084d、pGBKT7-T1084A的酶切鑒定

圖3 誘餌和供試靶蛋白表達質粒轉入AH109和Y187菌株的自激活實驗

3 討論

NtTkr尾部的CC3（1049-1143 aa）結構域中有個保守性基序 LIG-FHA-1［12］。FHA（Forkheadassociated domain）結構域通過介導蛋白與蛋白之間的相互作用，直接參與信號轉導、細胞周期調控和DNA損傷修復等過程［13-16］，LIG-FHA-1特定蘇氨酸殘基的磷酸化修飾對于蛋白結合是必需的，蘇氨酸殘基替換則會削弱蛋白間的相互作用［17］。磷酸化途徑目前已經被證實是體內驅動蛋白活性調控的一種重要手段［18-20］。NtTkr尾部1084位保守的蘇氨酸的磷酸化如果也調節其與靶底物的結合，那么T1084的替換或缺失突變，必然也能引起NtKrp與候選蛋白相互作用的削弱。因此我們將野生、T1084缺失或被丙氨酸替代的尾部分別與篩選到的三個候選蛋白H2A、NT3和Sufer進行酵母細胞內互作分析，結果替換突變的互作明顯強于野生，而缺失突變T1084d互作減弱，表明NtTkr與上述3個蛋白的相互作用與FHA結構域中保守蘇氨酸的磷酸化修飾無關。

圖4 T、T1084A和T1084d卷曲螺旋結構分析及其與3個候選蛋白間相互作用檢測

NtTkr卷曲螺旋結構T1084是極性親水氨基酸蘇氨酸位于七肽重復序列的a位。Lau等［21］將天然卷曲螺旋a、d位全部替換為疏水氨基酸，得到的蛋白卷曲螺旋結構比天然的穩定性更強。Monera等［22-23］研究發現丙氨酸在疏水核心中位置不同也可導致卷曲螺旋結構的改變。由此可知同Lau等一樣，將處于a位的極性親水蘇氨酸替換為非極性疏水丙氨酸增強了卷曲螺旋結構的疏水性和穩定性，這可能就是T1084A最先顯現藍色，顏色深而且菌株生長最好的原因。螺旋鏈的長度也影響卷曲螺旋結構的穩定性［24］，由圖4-A可知T1084的缺失突變使七肽重復序列縮短，因而會降低卷曲螺旋結構的穩定性，這也是T1084d生長最差，顯色最淺的原因。此前本室曾將EGFP融合的NtTkr全長和尾部轉入洋蔥表皮，二者均分布于胞質，但轉入洋蔥表皮的T1084d、T1084A卻在胞質和核中均有分布，而NtTkr本身并無核定位信號，其分布的改變顯然受與其結合的蛋白底物的影響。

4 結論

酵母雙雜交證實T1084缺失或替換可影響其與靶蛋白的結合強度，NtTkr與3個候選蛋白之間的相互作用與其尾部卷曲螺旋結構有關，故它們在細胞中分布的改變很可能是NtTkr與底物相互作用的改變引起的。