雷公藤內酯醇對脂多糖刺激的人成骨肉瘤細胞MG-63血管生成和炎性反應的抑制作用

林淼雄,彭 明,杜國友,陳 燕,林惠玲

(中山市中醫院：1.輸血與檢驗科；2.外三科；3.急診科，廣東中山 528400)

骨肉瘤是20歲以下青少年或兒童常見的惡性骨腫瘤，是兒童最常見的惡性骨腫瘤，占兒童腫瘤的5%[1]。骨肉瘤最突出的癥狀是腫瘤部位疼痛，主要由腫瘤組織的侵蝕和骨皮質的溶解所致[2]。骨肉瘤在幾個月內有向肺轉移的傾向[3]。腫瘤切除，放、化療是早期骨肉瘤患者的重要輔助治療方法，晚期患者往往只能選擇截肢。而截肢的5年生存率僅為5%～15%[4-5]。因此，迫切需要探索一種安全、有效的骨肉瘤治療方法。惡性腫瘤的轉移是一種復雜的生物學行為,血管生成是腫瘤生長轉移的形態學基礎。既往有研究表明，微血管密度與腫瘤轉移、發生及患者預后密切相關，包括骨肉瘤[6]。腫瘤細胞可通過直接細胞接觸或分泌旁分泌可溶性因子、誘導細胞修飾和細胞外基質改變腫瘤微環境[7]，尤其是炎性反應，許多炎癥介質可能影響細胞增殖和腫瘤的發展，其通過產生血管生成因子、生長因子、趨化因子、細胞因子和基質金屬蛋白酶而促進腫瘤細胞的侵襲和逃避免疫系統的監控[8]。因此，分子靶向抑制炎性反應和血管增生是治療骨肉瘤的潛在策略。

雷公藤內酯醇(TPL)是從雷公藤中提取的具有抗氧化、抗炎、抗癌等多種生物活性的二萜環氧化合物[9]。TPL在肺癌、結腸癌、骨肉瘤等多種癌癥中均具有調控細胞凋亡、遷移和轉移的作用[10-12]。此外，既往有研究表明，TPL是一種很有應用前景的抗血管生成藥物[13]。但TPL是否可通過調控血管生成和炎性反應而發揮其在骨肉瘤中的抗癌作用，目前尚不清楚。本研究探討了TPL對骨肉瘤細胞血管生成和炎性反應的影響及其可能的作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑 人成骨肉瘤細胞MG-63(中科院上海細胞庫提供)、杜氏改良Eagle培養基(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)、胎牛血清(FBS，HyClone,GE Healthcare Life Science,Logan,USA)、TPL(Sigma,St Louis,MO,USA)、二甲基亞砜(DMSO，Sigma,St Louis,MO,USA)、p38抑制劑——SB203580(Medchem Express,Monmouth Junction,NJ,USA)、p38激動劑——P79350(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)、四甲基偶氮唑藍比色法(MTT，Sigma,St Louis,MO,USA)、脂多糖(LPS，Sigma,St Louis,MO,USA)、人腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、低氧誘導因子-1α(HIF-1α)、血管內皮生長因子(VEGF)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(伊萊瑞特生物科技股份有限公司，武漢，中國)、TrIZOL(Life Technologies,Grand Island,NY,USA)、DNA反轉錄合成試劑盒(Takara Biotechnology，大連，中國)、SYBR q聚合酶鏈反應(PCR)Master Mix(Vazyme Biotech，南京，中國)；p38MAPK抗體(Cell Signaling Technology,Danvers,MA,USA)、辣根過氧化物酶(HRP)、山羊抗兔二抗免疫球蛋白G(銳抗生物科技有限公司，北京，中國)等。

1.2方法

1.2.1人成骨肉瘤細胞MG-63培養 人成骨肉瘤細胞MG-63在含10% FBS的培養基，37 ℃、5%二氧化碳及飽和濕度的二氧化碳培養箱中培養，2 d更換1次培養基，3～4 d進行1次傳代，選取狀態良好的處于對數生長期的細胞用于實驗。

1.2.3ELISA檢測細胞培養上清液中TNF-α、IL-6、HIF-1α、VEGF水平 選取狀態良好處于對數生長期的人成骨肉瘤細胞MG-63分別加入TPL(50、100、200 μg/mL)或TPL(200 μg/mL)+P79350(50 000 nM)預處理2 h,加入LPS(10 μg/mL)培養24 h，收集細胞培養上清液，離心去除細胞碎片，采用ELISA檢測細胞培養上清液中TNF-α、IL-6、HIF-1α、VEGF水平，具體操作步驟參制造商(伊萊瑞特生物科技股份有限公司，武漢，中國)的操作說明書進行。

1.2.4定量PCR(Q-PCR)檢測人成骨肉瘤細胞MG-63 TNF-α、IL-6、HIF-1α、VEGF表達水平 收集培養上清液后使用TrIZOL試劑從人成骨肉瘤細胞MG-63提取總RNA。使用帶有互補DNA合成試劑盒將1 μg總RNA反轉錄成DNA。PCR循環參數：30 ℃ 10 min，42 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min。以甘油醛-3-磷酸脫氧酶(GAPDH)為內參，使用SYBR qPCR Master Mix進行定量PCR檢測，Q-PCR的實驗結果采用2-ΔΔCq方法進行標準化和量化。引物序列：TNF-α正向引物5′-GAACTGGCAGAAGAGGCACT-3′，反向引物5′-GGTCTGGGCCATAGAACTGA-3′；IL-6正向引物5′-CCGGAGAGGAGACTTCACAG-3′,反向引物5′-CAGAATTGCCATTGCACA-3′；HIF-1α正向引物5′-TCTGGGTTGAAACTCAAGCAACTG-3′,反向引物5′-CAACCGGTTTAAGGACACATTCTG-3′;VEGF正向引物5′-TGCTTCTGAGTTGCCCAGGA-3′,反向引物5′-TGGTTTCAATGGTGTGAGGACATAG-3′;GAPDH正向引物5′-GGCATTGCTCTCAATGACAA-3′，反向引物5′-TGTGAGGGAGATGCTCAGTG-3′。

1.2.5Western-blot檢測TPL對磷酸化p38蛋白(p-p38)表達的影響 使用RIPA裂解液從細胞中提取全細胞蛋白，BCA法蛋白定量，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺電泳分離等量的細胞裂解液，轉入聚偏二氟乙烯膜，在5%脫脂牛奶中封閉1 h后用一抗在4 ℃下孵育過夜，回收抗體，用PBST洗滌多次后在室溫下用相應的二抗孵育1 h，最后采用ECL系統顯示蛋白條帶。導入GeneTool from Syngene軟件分析蛋白條帶灰度，以各組β-actin條帶的灰度值作為對照，標化其相應組的p-p38蛋白表達量。

1.2.6免疫組織化學染色檢測人骨肉瘤組織p-p38蛋白表達水平 對人骨肉瘤患者手術切除的病理組織標本進行脫水石蠟包埋切片，脫蠟水化，在10 mmol/L檸檬酸緩沖液(pH 6.0)中煮沸進行抗原提取。用3% H2O2溶液室溫避光孵育10 min滅活內源性過氧化物酶，一抗在4 ℃下孵育過夜，用PBST洗滌多次后在室溫下用相應的二抗孵育1 h，使用DAB底物試劑盒進行顯色反應，用蘇木素復染。

2 結 果

2.1LPS與TPL對人成骨肉瘤細胞MG-63的毒性檢測 不同濃度LPS(10、20、50 μg/mL)作用24 h人成骨肉瘤細胞MG-63細胞活力與對照組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，說明LPS(10、20、50 μg/mL)對人成骨肉瘤細胞MG-63不存在細胞毒性作用。見圖1。故優選10 μg/mL LPS作用于人成骨肉瘤細胞MG-63，建立理想的體外腫瘤細胞致炎模型。不同濃度TPL(50、100、200μg/mL)作用24 h人成骨肉瘤細胞MG-63細胞活力與對照組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖2。表明在實驗條件下，TPL(50～200μg/mL)與LPS(0～50 μg /mL)均對人成骨肉瘤細胞MG-63無明顯細胞毒性作用，實驗在該藥物濃度范圍內進行具有科學依據。

圖1 不同濃度LPS對人成骨肉瘤細胞MG-63 細胞活力的影響

2.2TPL對HIF-1α、VEGF的抑制作用 不同濃度藥物干預后人成骨肉瘤細胞MG-63 HIF-1α、VEGF表達量發生明顯變化。見圖3、4。LPS組HIF-1α、VEGF表達水平均明顯高于對照組和DMSO組。LPS組細胞上清液中HIF-1α表達量[(205.47±26.10)μg/mL]均明顯高于對照組[(53.85±7.36)μg/mL]和DMSO組[(49.52±8.33)μg/mL]。見圖5。LPS組細胞上清液中VEGF表達量[(256.06±38.52)μg/mL]均明顯高于對照組[(60.22±8.29)μg/mL]和DMSO組[(64.70±9.33)μg/mL]。見圖6。與LPS比較，不同濃度TPL(50、100、200 μg/mL)預處理2 h細胞上清液中HIF-1α、VEGF表達量呈濃度依賴性降低。當TPL濃度達到50 μg/mL時人成骨肉瘤細胞MG-63培養上清液中HIF-1α、VEGF表達量與LPS單獨刺激組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。當TPL上升至100 μg/mL時差異繼續增大，并隨TPL濃度的增加，差異趨向平穩。見圖3、4。TPL預處理后人成骨肉瘤細胞MG-63培養上清液中HIF-1α分泌量分別為(145.28±18.36)、(88.10±11.36)、(64.06±7.14)μg/mL，VEGF分泌量分別為(152.36±20.42)、(116.74±16.58)、(72.35±8.63)μg/mL，與LPS組比較，不同濃度TPL(50、100、200 μg/mL)預處理細胞上清液中HIF-1α分泌量分別降低29%、57%、68%。VEGF分泌量分別降低40%、54%、71%。見圖5、6。TPL可有效抑制LPS誘導的人成骨肉瘤細胞MG-63培養上清液中HIF-1α、VEGF的表達。

圖2 不同濃度TPL對人成骨肉瘤細胞MG-63 細胞活力的影響

注:與LPS組比較，*P<0.05

圖3不同藥物濃度對人成骨肉瘤細胞MG-63培養上清液中HIF-1αmRNA表達的影響

2.3TPL對炎性細胞因子——TNF-α、IL-6抑制作用 不同濃度藥物干預后人成骨肉瘤細胞MG-63培養上清液中炎性細胞因子——TNF-α、IL-6表達量發生明顯變化。LPS組TNF-α、IL-6表達量明顯高于對照組和DMSO組。LPS組細胞上清液中TNF-α表達水平[(228.16±36.77)μg/mL]明顯高于對照組[(53.41±6.14)μg/mL]和DMSO組[(58.37±10.19)μg/mL]。見圖7。LPS組細胞上清液中IL-6表達量[(177.85±30.77)μg/mL]明顯高于對照組[(40.41±3.14)μg/mL]和DMSO組[(38.75±6.19)μg/mL]。見圖8。與LPS比較，不同濃度TPL(50、100、200 μg/mL)預處理2 h細胞上清液中TNF-α、IL-6表達量呈濃度依賴性降低。當TPL濃度達到50 μg/mL時人成骨肉瘤細胞MG-63炎性細胞因子表達水平與LPS單獨刺激組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。當TPL濃度逐漸上升到100、200 μg/mL時差異繼續增大。見圖7、8。TPL預處理后人成骨肉瘤細胞MG-63培養上清液中TNF-α分泌量分別為(171.38±24.12)、(115.88±21.30)、(86.57±17.24)μg/mL，IL-6分泌量分別為(103.38±18.60)、(68.84±11.30)、(54.57±8.11)μg/mL，與LPS組比較，不同濃度TPL(50、100、200 μg/mL)預處理后人成骨肉瘤細胞MG-63培養上清液中TNF-α分泌量分別降低25%、49%、62%。IL-6分泌量分別降低41%、61%、69%。見圖9、10。TPL能顯著抑制LPS誘導的人成骨肉瘤細胞MG-63培養上清液中炎性細胞因子——TNF-α、IL-6的表達。

注:與LPS組比較，*P<0.05

圖4不同藥物濃度對人成骨肉瘤細胞MG-63培養上清液中VEGFmRNA表達的影響

注:與LPS組比較，*P<0.05

圖5不同藥物濃度對人成骨肉瘤細胞MG-63培養上清液中HIF-1α分泌量的影響

注:與LPS組比較，*P<0.05

圖6不同藥物濃度對人成骨肉瘤細胞MG-63上清液中VEGF分泌量的影響

注:與LPS組比較，*P<0.05

圖7不同藥物濃度對人成骨肉瘤細胞MG-63培養上清液中TNF-αmRNA表達的影響

注:與LPS組比較，*P<0.05

圖8不同藥物濃度對人成骨肉瘤細胞MG-63培養上清液中IL-6mRNA表達的影響

2.4TPL通過抑制p38MAPK信號通路發揮作用 各組人成骨肉瘤細胞MG-63培養上清液中p-p38蛋白表達比較，差異有統計學意義(F=94.479,P=0.001)。LPS組與對照組比較，表達量明顯增加。與LPS組比較，SB203580組及TPL各濃度組預處理2 h人成骨肉瘤細胞MG-63培養上清液中p-p38蛋白表達量明顯降低，并呈濃度依賴性，表明TPL能明顯降低LPS的作用。TPL(200 μg/mL)組與SB203580組比較，差異無統計學意義(q=0.259,P=0.857),TPL可有效抑制p-p38蛋白的表達。見表1。此外，與健康組織比較，人骨肉瘤組織p-p38蛋白表達量明顯增加。見圖11。與LPS組比較，TPL、P79350預處理組人成骨肉瘤細胞MG-63培養上清液中HIF-1α、VEGF、TNF-α、IL-6表達水平均未見明顯降低。圖3～10。TPL通過抑制p38MAPK信號通路抑制LPS刺激介導的人成骨肉瘤細胞MG-63血管生成和炎性反應。

注:與LPS組比較，*P<0.05

圖9不同藥物濃度對人成骨肉瘤細胞MG-63培養上清液中TNF-α分泌量的影響

注:與LPS組比較，*P<0.05

圖10 不同藥物濃度對人成骨肉瘤細胞MG-63 培養上清液中IL-6分泌量的影響

續表1 Western blot檢測TPL對人成骨肉瘤細胞MG-63 p-p38蛋白的影響

注:與對照組比較,*P<0.05；與LPS組(10 μg/mL)比較,#P<0.05

注:與正常組織比較，*P<0.05

圖11正常組織與人成骨肉瘤組織p-p38蛋白表達情況比較(×400)

3 討 論

3.1TPL對LPS誘導細胞MG-63血管生成的影響 腫瘤組織生長的微環境與腫瘤細胞的增殖和侵襲、轉移能力密切相關[14]。腫瘤組織周圍的生長因子、炎性細胞因子和蛋白水解系統的紊亂是微血管形成和腫瘤轉移相關的內在因素[15]。手術切除后的腫瘤轉移是骨肉瘤患者療效和預后欠佳的主要原因，因此，研究腫瘤組織的炎性反應和血管增生是治療骨肉瘤的潛在靶點和策略[16]。VEGF是內皮細胞特異性最高、促生長效果最強的關鍵調控因子[17]。大部分侵襲性強的腫瘤VEGF的表達量一般均很高。大量的臨床前和臨床研究數據表明，VEGF靶向制劑在卵巢癌、乳腺癌、非小細胞肺癌等動物移植模型中具有明顯的治療作用[18]。有研究表明，TPL可調控細胞增殖、凋亡、淋巴瘤和甲狀腺癌的侵襲、遷移和血管生成[19]。但TPL在骨肉瘤中的抗血管生成作用尚未見相關文獻報道。本研究結果顯示，TPL可有效抑制VEGF的表達，且抑制效果隨劑量增加而增強。此外，VEGF表觀遺傳學研究證實，大部分腫瘤存在HIF-1α高表達。既往有研究表明，HIF-1α在紅細胞生成、血管生成、細胞存活和腫瘤轉移中發揮著重要的調控作用[20]。因此，將HIF-1抑制劑用于靶向治療癌癥是新的治療策略。本研究通過TPL劑量依賴性抑制了MG-63細胞培養上清液中HIF-1α的表達水平。因此，推測TPL可通過抑制MG-63細胞培養上清液中HIF-1α、VEGF的表達而抑制血管生成，抑制骨肉瘤的生長和轉移。

3.2TPL對LPS誘導MG-63細胞炎性反應的影響 腫瘤細胞可通過直接細胞接觸或分泌旁分泌可溶性因子、誘導細胞修飾和細胞外基質改變腫瘤微環境[7]，尤其是炎性反應，許多炎癥介質可能影響細胞增殖和腫瘤的發展。TNF-α參與了免疫系統的維護和體內平衡,炎癥和宿主防御。癌癥細胞或基質細胞產生TNF-α參與了一系列腫瘤的發生與發展。其可激活核因子κB(NF-κB)信號通路，導致腫瘤細胞活化和細胞因子網絡失衡。通過NF-κB，TNF-α還可介導腫瘤細胞和巨噬細胞相互作用，增加惡性腫瘤細胞的侵襲性[21]。腫瘤患者血清TNF-α水平往往是升高的，腫瘤或基質細胞產生的TNF-α使腫瘤長期處于慢性炎癥的微環境[22]；可能會直接導致DNA損傷,抗腫瘤細胞凋亡或促腫瘤細胞有絲分裂,調節腫瘤與基質細胞相互作用,誘發一系列基質金屬蛋白酶、細胞因子、趨化因子而促進腫瘤發展。TNF-α的另一作用是促進IL-6的合成與釋放，尤其是單核細胞和巨噬細胞[23]。IL-6是一種糖蛋白和多功能細胞因子，除作為促炎性細胞因子外，其還會影響癌細胞的多種活性。隨著IL-6在協調先天免疫和適應性免疫方面的生理功能逐漸得到認識，IL-6已成為維持慢性炎癥和自身免疫的關鍵介質，且越來越多的研究證實，其是連接慢性炎癥和癌癥發展的關鍵細胞因子。與TNF-α一樣，IL-6可激活IL-6R/ Janus激酶/STAT3信號通路，上調Oct4基因的表達，促進非癌細胞在低附著培養條件下轉化為腫瘤干細胞，從而促進腫瘤的發展[24]。晚期癌癥患者IL-6水平升高，而人血清中IL-6水平升高與癌癥風險增加有關。因此，IL-6被認為可作為預測癌癥患者預后的標志物[25]。本研究結果顯示，TPL可劑量依賴性抑制MG-63細胞培養上清液TNF-α、IL-6的表達。因此，推測TPL可通過抑制MG-63細胞炎性反應而抑制腫瘤細胞血管生成和生長。

3.3TPL對p38MAPK信號通路的影響 絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路是多種信號通路的中心，是細胞接收、轉換與傳遞信號一類非常重要的分子，在細胞功能活動中具有關鍵作用，如細胞增殖、分化、凋亡和應對外界環境的刺激[26]。越來越多的證據表明，MAPK是調節腫瘤細胞增殖和生長信號通路的關鍵因子[27]；激活p38MAPK能促進細胞凋亡和自噬的發生[28]。同時，p38MAPK信號傳導級聯反應可受活性氧的調控，并參與了調控腫瘤血管的生成[29-30]。此外，p38MAPK信號通路還介導了心肌炎、肝炎等炎性反應[31- 32]，因而成為開發抗炎藥物的靶點。本研究結果顯示，經TPL處理后p-p38蛋白的表達量較LPS組下降，提示TPL抗LPS誘導的促血管生成和炎性反應可能與下調p38MAPK信號通路的活性有關，表明p38MAPK可能是TPL作用的靶點。

4 結 論

TPL通過抑制p38MAPK信號通路轉導能有效抑制骨肉瘤細胞的血管生成和炎性反應，為骨肉瘤提供了新的治療靶點，并為骨肉瘤的治療提供了研究基礎。