雙去甲氧基姜黃素對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用及機制

矯春麗，宋艷芹，杜源，盧永穎，張雷明

(1.煙臺大學藥學院，山東 煙臺 264005;2.煙臺市食品藥品檢驗檢測中心，山東 煙臺 264000)

肝損傷是臨床上的常見病,各種物理和化學因素均可導致急慢性肝損傷,嚴重或持續的肝損傷最終可導致急性肝功能衰竭,危及患者生命[1-2]。實驗性肝損傷包括化學性肝損傷、免疫性肝損傷、酒精性肝損傷及藥物性肝損傷等多種類型，其中四氯化碳(CCl4)是經典的誘導肝損傷動物模型的化學物質，當肝臟持續受到CCl4作用時，肝細胞內的多種酶大量釋放入血，包括谷丙轉氨酶(alanine transferase，ALT)、谷草轉氨酶(aspartate transferase，AST)及環氧化物酶-2等，其能促進炎癥反應的發生，最終導致肝纖維化[3-4]。細胞色素P450酶系(CYP450)將CCl4轉化為有毒的代謝產物，損傷細胞DNA和生物膜[5]。另外，肝細胞還能分泌大量的炎癥因子，其中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)能刺激免疫相關細胞產生大量細胞因子，引起局部或全身炎癥反應，還可激活細胞內相關死亡區域的蛋白，激活半胱氨酸蛋白酶(caspase)家族，最終誘導細胞凋亡[6]。

雙去甲氧基姜黃素(Bisdemethoxycurcumin，BDMC)、去甲氧基姜黃素和姜黃素統屬姜黃素類化合物，是從植物姜黃根莖中提取的一種植物色素，這3種成分結構簡單且相近，易于合成，具有多種相似的藥理活性，如抗炎、抗氧化、抗腫瘤等，無明顯的毒副作用[7]。過去姜黃素的藥理作用研究較多，但其穩定性較差，而三者中BDMC穩定性最好[8]，且抗炎活性較顯著。因此，我們擬采用CCl4誘導小鼠急性肝損傷(acute liver injury,ALI)，通過觀察小鼠血清中相關指標的變化及肝細胞凋亡情況，考察BDMC對肝損傷的預防作用，并初步考察其作用機制，為BDMC防治急性肝炎的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 BDMC(規格25 g/瓶，批號：B3347，東京化成工業株式會社)；聯苯雙酯滴丸(規格250丸/瓶，萬邦德制藥集團股份有限公司，批號：A02J180304)；CCl4(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20130426)；羧甲基纖維素鈉(天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20110809)。谷氨酸轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)試劑盒和腫瘤壞死因子α(TNF- α)、白細胞介素1β(IL-1β)ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)；兔抗cleaved-caspase-3、bcl-2、bax(凋亡相關蛋白)、β-肌動蛋白(β-actin)一抗和山羊抗兔二抗(萬類生物技術有限公司)。

1.2 實驗動物 SPF級昆明小鼠，雄性，體重18～22 g，由濟南朋悅實驗動物繁育公司提供，動物生產許可證號：SYXK(魯)20140007。自由攝食和飲水，飼養環境溫度22～24 ℃，相對濕度為40%～60%。

1.3 方法 72只KM小鼠隨機均分為對照組，模型組，聯苯雙酯100 mg·kg-1劑量(biphenyldimethy dicarboxylate，BDD100)組，BDMC 12.5、25及50 mg·kg-1劑量(BDMC12.5、BDMC25及BDMC50)組，每組12只。除對照組及模型組給予空白溶媒(0.5%羧甲基纖維素鈉)，其余各組每天灌胃給藥1次，連續給藥7 d，給藥體積20 mL·kg-1。末次給藥1 h后，除對照組(給予純橄欖油)外，其余小鼠腹腔注射1%CCl4橄欖油溶液誘導急性肝損傷。

1.4 血清ALT、AST、TNF-α、IL-1β水平的檢測 造模24 h后，摘眼球取血并分離血清。各項指標的檢測按照對應試劑盒說明書進行。

1.5 小鼠肝組織cleaved caspase-3、bax及bcl-2表達檢測 造模24 h后處死動物，將小鼠脫頸椎處死取肝，稱取20 mg肝組織加入250 μL RIPA裂解液于冰上勻漿，4 ℃下12 000 rpm 離心5 min，收集上清液，測定蛋白濃度。隨即將上清液加入5X上樣緩沖液，煮沸10 min。10% SDS-PAGE凝膠電泳后進行轉膜，隨即5%脫脂奶粉溶液封閉2 h，加入cleaved caspase-3、bax及bcl-2一抗于4 ℃過夜孵育。TBST洗膜10 min × 3 次，加入二抗常溫孵育1 h，同法洗膜，放入凝膠成像系統，曝光拍照。圖像分析用ImageQuant LAS 4000軟件計算吸光度值(A)。

2 結果

2.1 BDMC對ALI小鼠血清ALT及AST活力的影響 如表1所示，與對照組相比，模型組小鼠血清ALT及AST活力明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，BDD100、BDMC12.5、BDMC25及BDMC50組小鼠血清ALT及AST活力明顯降低(P<0.05，P<0.01)。結果表明肝損傷小鼠血清ALT及AST活力明顯增加；而給藥后小鼠血清ALT及AST活力明顯減少，說明BDMC對CCl4誘導的肝損傷有明顯的保護作用。

表1 BDMC對ALI小鼠血清ALT及AST活力的影響(U·L-1)

注：與對照組相比，#P<0.05，##P<0.01；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.2 BDMC對ALI小鼠血清TNF-α及IL-1β水平的影響 結果如圖2所示，與對照組相比，模型組小鼠血清TNF-α水平明顯增加(P<0.01)。與模型組相比，BDD100、BDMC25及BDMC50組小鼠血清TNF-α水平明顯降低(P<0.05，P<0.01)。與對照組相比，模型組小鼠血清IL-1β水平明顯增加(P<0.01)(見圖2A)。與模型組相比，BDD100、BDMC25及BDMC50組小鼠血清IL-1β水平明顯降低(P<0.05，P<0.01)(見圖2B)。結果表明ALI小鼠血清TNF-α及IL-1β水平明顯增加，而BDMC可明顯下調ALI小鼠血清TNF-α及IL-1β水平，說明BDMC對CCl4誘導的肝損傷有明顯的抗炎作用。

A.血清TNF-α水平；B.血清IL-1β水平圖2 BDMC對ALI小鼠血清TNF-α及IL-1β水平的影響(n=12) 注：與對照組相比， #P<0.05；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.3 BDMC對ALI小鼠肝組織bax/bcl-2及cleaved caspase-3表達的影響 結果如圖3所示。與對照組相比，模型組小鼠肝組織bax/bcl-2比值明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，BDMC12.5、BDMC25及BDMC50組小鼠bax/bcl-2比值均明顯降低(P<0.01)(見圖3A)。與對照組相比，模型組小鼠肝組織cleaved caspase-3表達明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，BDMC12.5、BDMC25及BDMC50組小鼠cleaved caspase-3表達均明顯降低(P<0.05)(見圖3B)。結果表明ALI小鼠肝組織發生凋亡；而BDMC低、中及高劑量均能明顯抑制ALI小鼠肝組織的凋亡。

A.bax/bcl-2；B.cleaved caspase-3表達圖3 BDMC對ALI小鼠肝組織bax/bcl-2及cleaved caspase-3表達的影響 注：與對照組相比， #P < 0.05,##P<0.01；與模型組相比，*P < 0.05,**P<0.01

3 討論

肝損傷的發病機制非常復雜，其中涉及多種因素和多種基因及其表達產物的調控，包括凋亡因子、炎癥介質的釋放等[9]。CCl4誘導的肝損傷模型是經典的實驗性肝損傷模型之一，此模型制備方便、易用且重復性好，成為研究肝損傷疾病的首選模型，可用于研究肝損傷的發病機制、治療和預防[10]。因此本研究采用CCl4誘導的小鼠急性肝損傷模型評價BDMC對急性肝損傷的影響。

CCl4經CYP450分解活化，會生成三氯甲基自由基和氯自由基，導致肝細胞脂質過氧化，細胞膜通透性增高，ALT及AST大量釋放入血，血清中ALT和AST活性顯著升高，因此ALT和AST活力常被用來作為檢測急性肝損傷的指標[11-12]。本研究發現，BDD及BDMC均能明顯降低ALI小鼠血清的ALT和AST活力。因此，BDMC對CCl4致小鼠急性肝損傷模型具有明顯的保護作用。聯苯雙酯滴丸為臨床治療肝炎的降酶藥物[13]，在本研究中其作為陽性藥物。

急性肝損傷中免疫細胞可被大量激活，導致TNF-α、IL-1β等多種促炎細胞因子大量釋放，進而引起炎癥級聯反應[14-15]。TNF-α與機體的炎癥嚴重程度呈典型正相關。IL-1β是是炎癥級聯反應激活的一個重要標志，可導致炎癥效應不斷放大[16-17]。本研究結果顯示，模型組血清TNF-α和IL-1β水平明顯增高，BDMC能明顯降低肝損傷小鼠血清TNF-α和IL-1β水平。提示BDMC可通過抑制炎癥反應減輕肝損傷。

細胞凋亡是一種程序性的細胞主動死亡，但凋亡過度則會引起細胞損傷，進而導致組織功能障礙[18-19]。線粒體凋亡體系中，bcl-2、bax是bcl-2家族與凋亡關系最密切的蛋白[20]。bax位于細胞線粒體膜上，促進細胞凋亡。bcl-2與bax作用相反，其位于細胞線粒體外膜上，通過減輕細胞內鈣超載、阻止線粒體PT孔的開放等抑制細胞凋亡[21]。bax高度表達可形成bax/bax同源二聚體來加速細胞凋亡的發生[22]。而bcl-2高表達時，bax與bcl-2可形成異源二聚體來抑制細胞凋亡，因此bax與bcl-2表達的相對失衡導致了細胞凋亡[23]。caspase-3被稱為“死亡執行蛋白酶”，cleaved caspase-3是裂解的caspase-3，是多種凋亡途徑的共同下游效應部分，切割特異性底物[24]。同時，bax、bcl-2可作為caspase-3的上游調控機制，還可作為其直接底物作用于下游，二者在細胞凋亡傳導過程中既相互聯系又相互制約[25]。本研究發現，此外，BDMC可上調肝細胞bcl-2的表達，下調cleaved caspase-3和bax的表達，減少bax/bcl-2的比值，提示BDMC可能通過抑制肝細胞凋亡從而發揮其保肝作用。

綜上，BDMC對CCl4致小鼠肝損傷模型具有明顯的保護作用。肝損傷小鼠炎癥因子及凋亡相關蛋白水平的變化說明，BDMC對ALI小鼠模型的保護作用可能是通過抗炎及抗凋亡等機制來實現的。