ROS對FOXO蛋白激活和基因表達的影響

呂舸，周吉芳，楊杰，丁啟龍

(中國藥科大學醫學基礎實驗教學中心，江蘇 南京 211198)

“Fork head”最初在果蠅體內發現，作為一種潛在的轉錄因子，隨后證明其有翼狀DNA結合區域，此時意識到它可能是已發現的其他轉錄調節因子，如HNF-3A，即現在的轉錄因子叉頭框蛋白A1(FOXA1)[1]。它存在于所有的真核生物中，在哺乳動物中叉頭框轉錄因子家族O亞族(FOXO家族)包括4個成員：FOXO1、FOXO3、FOXO4、FOXO6，在體內廣泛表達，FOXO6最晚被發現，在結構和功能上和其他3個差別較大[2]。FOXO家族均有一個由110個氨基酸構成的DNA結合結構域，結合到靶基因的TTGTTTAC序列，從而發揮作用，包括調節糖異生、細胞周期停滯、分化、DNA修復，自噬和細胞凋亡等。FOXO家族不同成員有不同的調節作用，FOXO1主要調節葡萄糖穩態，FOXO3是無脊椎動物、小鼠和人類中重要的調節壽命的因子，也和氧化應激反應和腫瘤抑制活性密切相關[3]。

機體氧化應激狀態下會產生過多的活性氧簇(ROS)，ROS是電子軌道最外層有未配對電子的活性基團，包括自由基和一些強活性的分子。活性氧過多產生會對機體產生危害，最初被認為是有毒的，是有氧代謝的產物。但現在發現ROS可以作為信號傳導的“第二信使”，在細胞信號通路中扮演重要角色，特別是在應激反應下，體內ROS會產生變化，對氧化應激進行調節[4]。

FOXO是細胞內應激應答的重要調節因子，刺激編碼抗氧化蛋白基因的表達，對抗細胞內的氧化反應[5]。另一方面，ROS也能在多種水平調節FOXO的活性，包括轉錄后修飾和轉錄修飾[6]。本文就ROS對FOXO活性和蛋白基因表達的調節進行綜述。

1 ROS在FOXO轉錄后修飾中的作用

FOXO的活性受到多種轉錄后修飾和核質穿梭的控制，最近FOXO合成的轉錄后修飾調節已經成為了FOXO功能調節的一種新的方式。有證據表明FOXO轉錄后修飾的調節方式主要用于應答應激刺激，包括氧化應激[5]。FOXO是各種激酶的底物，能夠被磷酸化、乙酰化、泛素化、糖基化和氧化等，這些修飾能夠影響FOXO的活性，如FOXO的DNA結合、轉錄激活活性、亞基定位、以及和轉錄共調節因子結合。

1.1 ROS影響FOXO蛋白的磷酸化修飾 磷酸化是FOXO轉錄后修飾的一種重要形式，它能夠影響FOXO的核質穿梭和DNA結合。引起FOXO磷酸化的主要是上游信號級聯,最重要的一條信號通路起始于胰島素受體和胰島素樣生長因子受體，通過作用于磷脂酰肌醇3′-激酶(PI3K)和絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)，引起FOXO的磷酸化失活以及出核[7]。ROS在胰島素受體(InsR)和胰島素樣生長因子受體(IDF1-R)級聯信號通路中能夠作用于多個位點，從而影響FOXO的磷酸化，影響FOXO的活性。蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)能夠作用于胰島素受體，使其去磷酸化和失活。PTP在其活性位點上有一個氧化敏感型半胱氨酸，能夠被活性氧氧化，從而失活[8]。磷酸酶和張力蛋白同系物(PTEN)通過催化磷酸肌醇的3′-去磷酸化來減弱PI3K信號傳導，和PTP類似，PTEN也能夠被活性氧滅活，PTEN暴露在H2O2中時，在其活性部位形成二硫鍵，從而失去活性[9]。Akt也能夠被活性氧氧化，從而抑制其活性。AKt暴露在活性氧中能形成亞磺酰化Akt，與親電子試劑反應，如與脂質過氧化產物4-羥基壬烯醛(HNE)邁克爾加成為敏感的半胱氨酸殘基，導致Akt抑制[10]。通常來說FOXO磷酸化后都會出核，并失活，但FOXO6通過PI3K-AKt通路磷酸化后，雖然失活，但卻仍在核內[11]。

1.2 ROS影響FOXO蛋白的乙酰化修飾 FOXO賴氨酸的乙酰化修飾能夠影響FOXO的活性和穩定性，減弱FOXO的DNA結合和轉錄活性，還會使FOXO易受磷酸化和出核的影響，同時賴氨酸的乙酰化也能夠穩定FOXO，使其免于相同位點的泛素化[12]。氧化應激造成的細胞內ROS水平增加，特別是H2O2，是FOXO乙酰化和泛素化的關鍵介質。CREB結合蛋白CBP和P300是組蛋白乙酰化酶的兩個亞型，ROS介導FOXO乙酰化的分子機制已經被初步闡明，外源性加入的低濃度的(25 μmol·L-1)H2O2能夠促進p300/CBP乙酰轉移酶和FOXO4之間通過二硫鍵形成二聚體[13]，它們之間的連接通過FOXO4上的半胱氨酸殘基C477介導。這種FOXO的半胱氨酸殘基在人類和哺乳動物中都是高度保守的，因此氧化還原敏感的異二聚體，可能為H2O2誘導的FOXO乙酰化的機制。但是最近的研究發現，在FOXO3a上的半胱氨酸殘基，并不和乙酰轉移酶結合[14]。

2 ROS在FOXO基因轉錄調節中的作用

2.1 ROS影響miRNA對FOXO蛋白表達的調節 目前，在一些病理生理過程中許多miRNA已經被作為FOXO表達的調節因子，包括在抗原激活的TH淋巴細胞克隆擴增，老化期間造血干細胞(HSC)的維持，心臟肥大，和某些神經退行性疾病中，都有此調節過程。許多直接作用于FOXO mRNA的miRNA也與腫瘤促進，生長或轉移有關：例如，在肺癌和黑色素瘤中miR-182靶向直接作用于FOXO3 mRNA[15];相同的FOXO3 mRNA也被miR-155靶向調控，促進胰腺癌中的氧化應激[16]。

經過初步研究發現，氧化應激能夠抑制Janus激酶-信號轉導與轉錄激活因子(JAK-STAT)信號通路被細胞因子的激活[17]，隨后又發現，在氧化應激狀態下，STAT5↑/miR-182↑/FOXO1↓信號通路，可以被快速轉變為上調FOXO的表達(STAT5↓/miR-182↓/FOXO1↑)。將SK-N-MC人神經母細胞瘤細胞暴露于300 μmol·L-1的H2O2中，會使STAT滅活，10倍下調miR-182，最終使FOXO1蛋白水平增加4倍[18]。

2.2 ROS影響RNA結合蛋白對FOXO蛋白表達的調節 HuR是一種AU富含元件(ARE)結合調節蛋白，可特異性的結合靶RNA的ARE，參與細胞存活，細胞分裂，免疫應答，能夠促進mRNA穩定，并作為翻譯促進因子[19]。通常在細胞核內，感受應激刺激后(包括氧化應激)，轉移到細胞質。細胞暴露于氧化應激環境中后，會使p38-MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)激活，之后直接或間接刺激HuR磷酸化，導致其與靶mRNA的結合和在細胞質中的積聚。HuR本身也是氧化還原的感受器，HuR為同源二聚體時得到全部活性。三個HuR RNA識別位點中的第一個半胱氨酸殘基通過形成分子間二硫鍵促進同源二聚化[20]。因此氧化還原敏感的半胱氨酸，通過使HuR形成同源二聚體，應答氧化應激刺激。目前已在FOXO1 RNA的3′-UTR和內含子區域鑒定出HuR結合位點[21]，而在FOXO3 mRNA中僅發現內含子中的HuR結合位點。HuR在MDA-MB-231乳腺癌細胞中過表達能夠穩定FOXO1mRNA，提高FOXO1的蛋白水平。在5-氟尿嘧啶(5-FU)的應激刺激下，會導致內源性HuR上調，最終導致細胞FOXO1水平增加。5-FU誘導的細胞凋亡幾乎完全被同源siRNA介導的內源性HuR敲除所抑制，并在HuR-siRNA存在下通過異位FOXO1的過表達而重新發揮作用。 總之，這些數據表明，當暴露于應激刺激時，HuR介導FOXO1上調，從而誘導癌細胞凋亡。

第二個參與FOXO轉錄后修飾的RNA結合蛋白是Quaking(QKI)[22]。是mRNA剪切、轉移、穩定和轉錄的調節因子，協助調節細胞分化和細胞周期，還起到腫瘤抑制的作用[23]。Galarneau和Richard[24]定義了QKI反應元件(QRE)的共有序列(NACUAAY-N1-20-UAAY)，并使用生物信息學分析預測了小鼠中1 400個以上QKI mRNA靶標。

在MCF- 7乳腺癌細胞中，FOXO1 mRNA的3′-UTR結合了miR-27a，miR-96、miR-182和QKI蛋白、HuR蛋白[25]。用反義抑制劑靶向抑制這些miRNA和敲除QKI，它們對內源性FOXO1表達影響相同，都導致FOXO1 mRNA和蛋白質水平的上調。對比HuR在FOXO1的mRNA 3′-UTR內的結合位點ARE和QKI的結合位點QRE，發現在3′-UTR區域內，第二個ARE與第三個QRE重疊。這種結合位點的排列提示了兩種調節蛋白對FOXO1轉錄調節相互排斥的可能性。對MDA-MB-231乳腺癌細胞的5-FU處理導致FOXO1上調，同時上調HuR和下調QKI。 由此我們可以推測FOXO1的轉錄后調節涉及特定miRNA，HuR和QKI之間的功能性相互作用，以這種方式，FOXO1蛋白可以通過這些相互作用在轉錄后上調，以應對各種應激刺激，包括氧化應激。

未來的實驗需要確定這兩種影響是否是獨立的，即在一個實驗中同時miRNA抑制和QKI敲除是否具有加性效應并導致FOXO1上調增多。 另外，miRNA和QKI的作用可以相互關聯，然后預期僅針對一種因子(例如靶向miRNA)的治療也會阻止另一種因子(例如QKI)與3′-UTR的結合。

2.3 ROS影響p53對FOXO蛋白表達的調節 腫瘤抑制蛋白p53能夠維持基因組完整性。為了調節細胞應激產生的DNA損傷，野生型p53協調了許多基因的轉錄，并通過靶基因的差異激活將細胞導向細胞周期停滯、衰老或凋亡，防止DNA繼續受損。最近有研究發現，腫瘤抑制因子p53是FOXO3a的上游調節因子。順鉑和銀杏葉的藥理學研究表明，化療藥物誘導的ROS增加了癌基因C-myc[26],升高的C-myc水平抑制p21Cip1的p53-反式激活，抑制細胞周期停滯，但不影響促凋亡基因PUMA的p53-反式激活，從而導致細胞凋亡激活。

除了ROS和p53通過信號傳導網絡之間的相互作用，ROS的直接作用也可能影響p53的激活。p53的穩定性和活性受到多種共價翻譯后修飾的影響，如磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等。p53的磷酸化，甲基化和乙酰化通常導致其穩定，積累和活化。在這些翻譯后修飾中，ROS與p53介導的磷酸化有關，通過蛋白激酶，包括p38α-MAPK，共濟失調毛細血管擴張癥突變蛋白(ATM)和細胞外信號調節激酶(ERK)。然而，這些蛋白激酶的激活不一定是ROS特異性的，這些蛋白激酶是響應DNA損傷的信號傳導途徑的常見下游效應物。由于存在含有氧化還原敏感型的半胱氨酸(Cys)，p53本身具有氧化還原活性。在p53 DNA結合域中存在兩個半胱氨酸簇，其對于p53與其共有序列的特異性結合是必需的。Cys 124、135、141、182和277位于p53的DNA結合域，構成了氧化還原調制的結構平臺。

從理論上講，蛋白質中有多種可能的氧化巰基結構，包括磺酸(-SOH)，二硫化物(-S-S-)，次磺酰胺(-SNR1R2)，亞磺酸(-SO2H)和磺酸(-SO3H)。已經觀察到用氧化劑處理p53能夠取消它的DNA結合活性。最近的研究確定了p53氧化的作用位點，發現在氧化劑處理后GSH會與Cys124、Cys124結合，連接通過二硫鍵與p53連接，降低p53的DNA結合活性，該過程可被抗氧化劑逆轉[27]。

3 ROS對FOXO的調節與FOXO轉錄共調節因子

轉錄共激活因子PGC-1α是碳水化合物和脂質代謝以及線粒體生物合成和功能的上游調節因子，并且能夠在不同的系統里調節FOXO的活性[28]。PGC-1α通過與FOXO1a共同作用，正向調節空腹誘導的肝臟糖異生。相似的，FOXO1a誘導的肝細胞中硒蛋白P(SelP)的表達也能夠通過與PGC-1α共同作用而加強[29]。在內皮細胞和骨骼肌細胞中，PGC-1α也可以與FOXO3a共同作用調節抗氧化蛋白的表達[30]。

在腎臟中，高脂飲食引起的腎臟脂毒性與胰島素抵抗和血脂異常有關，可能是由于FOXO3a和PGC-1α的下調和氧化應激增加。給藥自由基清除劑TEMPOL,通過調節PI3K-Akt-FOXO信號傳導來預防腎損傷[30]，改善了高脂飲食誘導的腎損傷，這可能是由于FOXO3a和PGC-1α的上調導致了對氧化應激和脂肪細胞凋亡的保護作用[31]。轉錄輔因子和賴氨酸脫甲基酶(KDM)通過與FOXO共同作用能夠誘導抗氧化防護基因的表達，這表明該復合物的主要作用是維持氧化應激抗性基因的基礎表達，而不是它們對外源氧化應激反應的影響[32]。該結果進一步表明，FOXO進入不同的染色質環境和核微環境可能依賴于不同的輔助因子。

4 總結與展望

雖然氧化應激可能導致許多疾病的發生，但低生理濃度的ROS，特別是過氧化氫，已成為激素和生長因子介導的細胞代謝控制中不可缺少的信號分子。FOXO的活性和細胞氧化還原狀態本質上是相互聯系的，FOXO充當細胞氧化還原傳感器，通過磷酸化，乙酰化和泛素化在翻譯后進行修飾，對氧化應激反應，影響FOXO細胞質核穿梭、FOXO穩定，最終影響FOXO靶基因的轉錄。ROS也能夠在轉錄水平影響FOXO的表達，miRNA和p53是FOXO的上游信號分子，ROS能夠間接通過控制他們的活性來調節FOXO的表達。HuR和QKI是RNA結合蛋白，能夠與FOXO的RNA結合控制FOXO的轉錄，在氧化應激狀態下，HuR和QKI相互作用，使FOXO蛋白在轉錄后上調，以應對氧化應激刺激。

此外，FOXO還能以氧化還原敏感的方式與其他蛋白(包括共調節因子和抗氧化酶)相互作用，并且有一些證據表明FOXO基因表達本身具有氧化還原敏感性調節作用。另一方面，一些FOXO靶基因是抗氧化酶，它們通過催化歧化和減少超氧化物和過氧化氫來影響細胞內和細胞外氧化還原狀態。 FOXO介導的基因表達的最終結果影響氧化損傷后的細胞命運，誘導凋亡細胞死亡或細胞周期停滯和隨后的修復過程。在生理條件下，FOXOs參與細胞分化，能量代謝，調節營養穩態,在與氧化應激相關的一些病理條件下FOXO過度活化可能增加2型糖尿病的代謝紊亂或癌癥。所以需要繼續深入研究ROS對FOXO活性和表達的影響，從而能夠進一步明確疾病的發病機制，為研發新的藥物提供思路。