慢性鋁中毒小鼠學習記憶能力與大腦皮層乙酰膽堿和β-內(nèi)啡肽關系的研究

蒙縝之 廖美愛 李婷 梁舒婷 鄧凱戈 潘鳳婷 王凌風 尚鵬飛 黃彥峰 黃俊杰

鋁元素廣泛存在于自然界，由于其良好的理化性質(zhì)而被廣泛應用于各個領域。隨著人類接觸和使用鋁的情況日益增多，一定程度上增加了鋁在人體的蓄積。鋁是一種慢性神經(jīng)毒性物質(zhì)，長期接觸鋁可引起學習記憶功能減退、認知功能障礙等癥狀[1，2]，然而鋁中毒損傷學習記憶的機制尚未完全明確。本研究擬通過檢測鋁中毒小鼠大腦皮層乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）和β-內(nèi)啡肽（β-endorphin，β-EP）的含量，探討大腦皮層ACh和β-EP在鋁中毒機制中的作用，為闡明鋁的神經(jīng)毒性機制和后續(xù)的干預研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級昆明小鼠32只，12周齡，體重20～25g，購自右江民族醫(yī)學院實驗動物中心[動物合格證號：SCXK（桂）2012-0003]，雌雄分籠飼養(yǎng)，每籠8只。

1.1.2 主要實驗試劑及儀器 三氯化鋁（AlCl3，天津市大茂化學試劑廠），乙酰膽堿試劑盒、考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；小鼠內(nèi)啡肽試劑盒（Sigma 公司）。FSH-2可調(diào)高速勻漿機（江蘇省金壇市宏華儀器廠），Y 型迷宮刺激器（MG-B，張家港市教學實驗器械廠），小型離心機（上海安亭科學儀器廠），大型離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組建模 取小鼠32 只，雌雄各半，隨機分成低、中、高劑量染毒組和對照組，每組8 只。低、中、高劑量組用16g/L 濃度的AlCl3水溶液，每日分別按1.2mg/kg、12mg/kg、120mg/kg 劑量，拌飼料喂養(yǎng)，直至實驗結束，連續(xù)90d；對照組普通飼料正常飼養(yǎng)。

1.2.2 小鼠學習記憶能力測試 小鼠的學習和記憶行為能力用Y型迷宮刺激器進行檢測。Y型迷宮由3只短臂組成，以小鼠所在短臂為起步區(qū)，另兩只短臂中隨機選擇一只為安全區(qū)，一只為非安全區(qū)。安全區(qū)燈泡開亮，銅柵無電流；起步區(qū)和非安全區(qū)燈泡不亮，銅柵有電流。控制開關打開后，安全區(qū)燈光立刻亮起，起步區(qū)和非安全區(qū)延遲2s后通電。若小鼠在燈光亮起時能成功逃向安全區(qū)，則記為“正確”，否則記為“錯誤”。按文獻[3，4]的實驗方法和標準，將小鼠達到學會標準時所需的測試次數(shù)，作為大鼠學習行為能力的檢測指標。學習能力檢測24h后，依照上述方法對小鼠連續(xù)進行20 次測試，記錄大鼠在20次測試中的錯誤次數(shù)，作為小鼠記憶行為能力的檢測指標。

1.2.3 樣本采集及制備方法 動物斷頭處死，在冰臺上快速取大腦皮層，一半大腦皮層放入-80℃冰箱保存，送廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心，用于測定小鼠大腦皮層鋁含量。另一半大腦皮層，用冰生理鹽水漂洗置于濾紙吸干，切取組織塊0.4g，置于勻漿試管中，加入生理鹽水3.6ml后進行勻漿，離心（3 500r/min）10min，取上清液，制成10%的勻漿4℃冰箱保存待測。

1.2.4 大腦皮層主要觀察指標 用微波消解-電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜（ICP-AES）法[5]測定大腦皮層鋁的含量；ELISA法檢測大腦皮層ACh和β-EP含量；用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量。測試步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，各組均數(shù)間的差異性采用單因素方差分析比較，兩兩組間比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況低劑量染毒組和對照組小鼠均活潑好動，飲食無明顯改變，毛色較光亮；中、高劑量染毒組小鼠活動減少，進食量減少，毛發(fā)蓬松少光澤。

2.2 小鼠Y 型迷宮實驗學習和記憶檢測結果Y型迷宮實驗結果顯示：各組間學習測試次數(shù)和記憶錯誤次數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與對照組相比，中、高劑量鋁中毒組學習測試次數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與低劑量組相比，中、高劑量組學習測試次數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與對照組相比，低、中、高劑量鋁中毒組記憶錯誤次數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；與低劑量組相比，中、高劑量組記憶錯誤次數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表1。

表1 小鼠Y型迷宮學習和記憶檢測結果（±s，n=8）

表1 小鼠Y型迷宮學習和記憶檢測結果（±s，n=8）

注：與對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與低劑量組比較，cP＜0.01，dP＜0.05

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組學習測試次數(shù)15.13±1.64 17.00±1.31 20.13±2.30bc 22.25±2.71bc記憶錯誤次數(shù)4.25±1.04 5.88±1.36a 7.88±1.46bd 10.88±2.23bc

2.3 小鼠大腦皮層鋁、ACh 和β-EP 含量各組間大腦皮層鋁、ACh、β-EP 含量差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）。與對照組相比，中、高劑量鋁中毒組大腦皮層鋁含量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；與低劑量組相比，中、高劑量組大腦皮層鋁含量差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。與對照組相比，中、高劑量組大腦皮層ACh 含量差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；與低劑量組相比，高劑量組大腦皮層ACh含量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與對照組相比，低、中、高劑量組大腦皮層β-EP含量差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；與低劑量組相比，高劑量組大腦皮層β-EP 含量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 小鼠大腦皮層鋁、ACh和β-EP含量測定結果（±s，n=8）

表2 小鼠大腦皮層鋁、ACh和β-EP含量測定結果（±s，n=8）

注：與對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與低劑量組比較，cP＜0.05，dP＜0.01

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組鋁(mg/kg)48.96±9.25 52.21±12.20 63.65±11.69ac 76.95±11.17bd ACh（μg/mg prot）9.92±2.28 8.24±1.72 7.58±2.15a 4.79±1.31bd β-EP(pg/ml)45.16±6.47 39.58±2.65a 36.17±7.81b 33.98±2.50bc

3 討論

研究表明ACh 是中樞膽堿能系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，是由膽堿能神經(jīng)元產(chǎn)生的化學遞質(zhì)，膽堿能系統(tǒng)與學習記憶的形成和存儲有關[6，7]。β-EP是腦組織內(nèi)具有嗎啡樣活性的多肽，屬于內(nèi)源性阿片樣物質(zhì)，相關研究表明，血管性癡呆模型大鼠腦組織及血漿β-EP含量降低，并且其降低程度與癡呆程度密切相關[8，9]。有研究表明[10，11]，鋁可導致大鼠學習記憶能力下降，認為可能與大鼠海馬AMPA 受體蛋白表達水平下降、海馬內(nèi)CaN 的表達增加、全基因組甲基化率降低等有關，但其確切機制有待進一步研究。鋁中毒引起的學習記憶障礙是否與腦內(nèi)ACh和β-EP含量有關尚未明確。

本研究以飼喂含不同劑量AlCl3的飼料對小鼠染毒90d 后顯示：鋁暴露組Y 型迷宮實驗學習訓練次數(shù)和錯誤次數(shù)均高于對照組，且高劑量組這兩項指標比低、中劑量組均升高，這說明鋁中毒可致小鼠學習記憶能力下降。小鼠大腦皮層鋁含量測定結果也顯示，各劑量鋁中毒組小鼠大腦皮層鋁含量均高于對照組，且不同劑量組大腦皮層鋁含量比較也有差異，鋁中毒組大腦皮層鋁含量增高，小鼠學習測試次數(shù)和記憶錯誤次數(shù)均增加，這與文獻報道[12，13]一致，提示不同劑量鋁暴露組引起大腦鋁蓄積，導致小鼠學習記憶功能障礙。本研究結果還顯示，各劑量鋁中毒組大腦皮層鋁含量增高，小鼠學習測試次數(shù)和記憶錯誤次數(shù)也增加的同時，其大腦皮層ACh和β-EP含量反而明顯低于對照組，且大腦皮層內(nèi)鋁含量越高，小鼠學習記憶能力下降越明顯，大腦內(nèi)ACh和β-EP也隨之明顯下降，呈現(xiàn)一定的劑量效應關系，提示鋁可能通過降低腦內(nèi)ACh和β-EP的含量影響小鼠學習記憶能力，這可能是鋁致小鼠認知能力障礙的機制之一，但其具體機制還有待進一步研究。