茵陳四苓顆粒聯合骨髓間充質干細胞移植對急性肝衰竭大鼠NF-κB、iNOS及TNF-α的影響研究*

馬浩軒 田光敏 劉 鵬△ 彭 琴 王 絨 鐘庭燕

（1.西南醫科大學附屬中醫醫院，四川 瀘州 646000；2.四川省自貢市第四人民醫院，四川 自貢643000）

急性肝衰竭是發展迅速的嚴重肝臟疾病，可由多種病因引起，臨床上以嚴重肝功能損傷、凝血功能異常、肝性腦病等為主要表現［1]。目前尚缺乏有效治療手段，人工肝、西醫綜合治療等療效欠佳。肝臟移植可從根源上治療急性肝衰竭，但因供肝來源稀少、手術昂貴及術后排異反應等限制了肝臟移植的廣泛應用［2-3]。現有研究表明［4]，急性肝衰竭的主要病理機制為肝臟內環境紊亂，炎癥因子釋放致內毒素血癥形成，肝細胞大量凋亡壞死，導致肝臟功能急劇惡化，預后極差。治療關鍵點在于控制促炎因子生成、減輕肝臟炎癥、改善內毒素血癥環境、減少肝細胞死亡。骨髓間充質干細胞（BMSCs）是來源于骨髓的多能干細胞，因其具有多向分化潛能、易于培養、修復增殖能力突出等優點而受到青睞［5]。 已有研究發現［6]，BMSCs 與肝細胞具有一定同源性，其不僅具有提升免疫及抗纖維化能力［6-7]，還具有炎癥調節、抑制細胞凋亡等作用［7-8]。基于上述發現，BMSCs已逐步成為再生醫學及細胞領域研究的重點與熱點，不少學者已將其應用于終末器官衰竭的研究中，以期取得更好的治療效果。

急性肝衰竭在中醫內科學中可歸屬“鼓脹”“積聚”“急黃”等范疇，總的病機可歸納為濕熱邪毒交結致瘀血內阻、熱瘀搏結。臨證以清熱解毒、涼血化瘀為其基本治法，茵陳四苓顆粒為代表方劑。茵陳四苓顆粒為西南醫科大學附屬中醫醫院肝病科孫同郊教授經驗方所成，前期研究發現，肝衰竭體外環境下，茵陳四苓顆粒含藥血清可提高BMSCs的肝向分化及免疫調節能力［9]，但具體機制未做深入探討。本實驗就茵陳四苓顆粒聯合BMSCs移植治療急性肝衰竭大鼠，從炎癥通路及相關促炎因子的轉錄方面進一步探索中藥聯合干細胞治療急性肝衰竭大鼠的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SPF級SD大鼠10只，2～3周齡，體質量100～120 g，作干細胞分離用。健康雄性SD 清潔級大鼠 60 只，6～8周齡，體質量 180～200 g，用于動物實驗。動物由西南醫科大學動物實驗中心提供，動物生產許可證號：SCXY （川）2008-17，使用許可證號：SCXY（川）2008-065。

1.2 試藥與儀器 1）試藥：茵陳四苓顆粒（組成：茵陳、梔子、大黃、白公翁、茯苓、白術等，西南醫科大學附屬中醫醫院制劑室制備，川藥制字Z20070525，許可證號：川20160039HZ）；復方甘草酸苷片（日本米諾發源制藥株式會社，規格25 mg/片，國藥準字J20130077，批號 16027）。 2）硫代乙酰胺（TAA）（北京化學試劑公司）；L-DMEM 培養基、胎牛血清（Hyclone 公司）；NF-κB單克隆抗體 （Abcam公司）；SABC免疫組化染色、DAB、PCR試劑盒 （Roche公司）；RT-PCR引物設計（上海生工）。2）儀器：CO2培養箱（3111系列直熱式，美國 Thermo）；-80℃超低溫冰箱（Thermo991，美國熱電）；醫用低速離心機（白洋400c，北京白洋）；熒光定量 PCR 儀（Realplex2，德國 eppendorf）；凝膠掃描成像系統（GelDocXR，美國伯樂公司）。

1.3 大鼠BMSCs的分離、純化與體外培養大鼠置于操作臺，予以脫頸處死。將大鼠浸泡于75%酒精中消毒。后轉移至超凈工作臺，全骨髓貼壁法分離培養大鼠BMSCs。剪去大鼠雙側腿骨，剝凈皮毛及肌肉筋膜，剪去兩端骨骺，予以細胞培養基反復快速沖洗骨髓腔，無菌條件下收集干細胞懸液，調整細胞濃度至1.0×106個/mL，靜置細胞培養箱中孵育培養（37℃，5%CO2）。每隔2 d全量換液，觀察記錄細胞形態。每于細胞鋪滿皿底約90%面積時予以胰酶消化傳代。傳至P3代時，細胞呈旋渦狀緊密排列，經流式細胞儀鑒定后備用。

1.4 模型制備 將大鼠隨機分為6組，包括正常組、模型組、陽性對照組、中藥組、干細胞組、聯合組。大鼠自由進食飲水，適應性喂養1周后用于造模。造模前12 h禁食不禁水，采用硫代乙酰胺（TAA）400 mg/kg灌胃，間隔24 h重復1次，制備急性肝衰竭模型，正常組予以等量生理鹽水灌胃。觀察大鼠精神狀態、毛發色澤、進食水量、體質量等變化。造模后模型組大鼠血清ALT、AST水平較正常組明顯升高，肝組織病理染色提示急性肝損傷表現，肝細胞壞死、凋亡，大量炎癥細胞浸潤，肝小葉結構破壞，表明成功完成急性肝衰竭模型制備。

1.5 給藥方法 將5 g茵陳四苓顆粒溶于20 mL蒸餾水中，調整質量濃度為250 mg/mL。按照標準體質量動物間藥物劑量換算將復方甘草酸苷片配置成質量濃度為23 mg/kg的溶液常溫備用。造模成功后中藥組及聯合組予以茵陳四苓顆粒1.5 g/kg灌胃，每天2次，陽性對照組予以復方甘草酸苷片23 mg/kg灌胃，其余各組等量生理鹽水灌胃；干細胞組及聯合組尾靜脈注射干細胞懸液1.0×106個/mL，其余各組尾靜脈注射等體積（1.2 mL）細胞培養基。

1.6 標本采集及檢測 干預72 h后，大鼠麻醉后開腹，腹主動脈采血，右肝相近部位取肝組織，部分予以4%多聚甲醛固定，進行后續病理觀察及核因子-κB（NF-κB）免疫組化檢測，部分置于凍存管內，用于iNOS及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）檢測。 1）生化指標檢測：腹主動脈采血后離心，經全自動生化分析儀檢測血清AST、ALT及血漿內毒素（ET）水平。2）肝臟病理觀察：肝組織經4%多聚甲醛固定48 h后，常規包埋、切片、脫蠟、HE染色、脫水、石蠟封片，光鏡下觀察各組大鼠肝組織病理變化。3）SABC免疫組化法檢測肝組織中NF-κB的表達。按說明書步驟進行，山羊血清常溫封閉20 min后滴加一抗，4℃過夜，PBS清洗后加入二抗（生物素標記羊抗兔抗體），37℃溫箱中放置30 min，清洗后滴加SABC，溫箱靜置后DAB顯色，后經脫水、透明、封片、晾干等處理。切片經Image-Pro Plus 6.0進行平均光密度值檢測，積分光密度（IOD）值表示NF-κB表達強度。陽性表現：細胞染呈棕黃色，定位于細胞核和（或）細胞質。4）RT-PCR檢測肝組織中TNF-α及iNOS基因表達。按照RNA抽提試劑盒說明書方法提取總RNA后進行逆轉錄，合成cDNA。取cDNA產物2 μL，反應體系為 20 μL，擴增條件為：95 ℃預變性5 min，95℃變性 15s，60℃［TNF-α]，58℃［iNOS]退火15 s，72℃延伸30 s，擴增40個循環，以GAPDH作為內參作數據分析。引物設計根據GenBank公布的基因序列，設計合成均由上海生工完成。見表1。

表1

1.7 統計學處理 應用SPSS22.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間均數比較采用方差分析（ANOVA）。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠血清AST、ALT及血漿ET水平比較見表2。72 h后各組AST、ALT及血漿ET水平明顯低于模型組，差異具有統計學意義（P＜0.01），但各治療組大鼠血清AST、ALT及ET水平較正常組仍高 （P＜0.01）。聯合組肝功能損傷程度及ET水平最低，與其他治療組比較，差異顯著（P＜0.01），其余各治療組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠血清AST、ALT及血漿ET比較（±s）

表2 各組大鼠血清AST、ALT及血漿ET比較（±s）

與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與聯合組比較，▲P＜0.01。下同

組 別 n ET（EU/mL）正常組 10 0.097±0.01模型組 4 0.59±0.01*陽性對照組 5 0.41±0.01*△▲ALT（U/L） AST（U/L）55.20±6.36 71.30±7.50 747.75±20.78* 779.75±12.79*381.20±15.90*△▲ 398.80±19.08*△▲中藥組 5 0.39±0.01*△▲389.20±14.04*△▲ 416.20±14.82*△▲干細胞組 6 383.67±13.74*△▲ 406.67±13.95*△▲ 0.40±0.02*△▲聯合組 7 281.00±15.86*△ 276.71±13.07*△ 0.20±0.01*△

2.2 各組大鼠肝臟病理組織觀察結果 見圖1。干預72 h后模型組大鼠肝小葉結構紊亂，肝細胞彌漫壞死，肝索破壞，炎性細胞浸潤明顯；72 h后各治療組肝小葉結構較模型組有所恢復，肝細胞壞死程度減輕，可見部分增生肝細胞，炎性浸潤減輕，其中聯合組損傷程度最輕。

圖1 各組大鼠肝臟病理組織觀察結果（HE染色，400倍）

2.3 各組大鼠肝組織NF-κB表達水平比較 見表3，圖2。正常組肝組織中存在少量NF-κB表達。相較于正常組，其余各組表達NF-κB的細胞數量明顯增加（P＜0.01）。干預72 h后，各治療組NF-κB表達水平明顯低于模型組（P＜0.01）。但與正常組比較，NF-κB表達仍高，差異具有統計學意義（P＜0.01）。各治療組間相比，NF-κB表達水平以聯合組降低最為顯著（P＜0.05），其余治療組間表達程度無明顯差異（P＞0.05）。

表3 各組大鼠肝組織NF-κB免疫組化表達水平比較（±s）

表3 各組大鼠肝組織NF-κB免疫組化表達水平比較（±s）

組 別 n正常組 10模型組 4陽性對照組 5 NF-κB 172.40±6.65 292.00±11.60*245.80±8.53*△▲中藥組 5 240.40±5.08*△▲干細胞組 6 237.83±5.04*△▲聯合組 7 207.00±7.12*△

圖2 各組大鼠肝組織NF-κB免疫組化結果（DAB染色）

2.4 各組大鼠TNF-α、iNOS基因轉錄水平比較 見表4，圖3。正常組肝組織中存在少量TNF-α、iNOS基因轉錄。干預72 h后，與正常組相比，其余各組TNF-α、iNOS基因轉錄水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，各治療組中TNF-α、iNOS的基因轉錄水平均明顯降低，且差異顯著（P＜0.01）；各治療組間比較，以聯合組基因轉錄水平降低最為顯著（P＜0.05），其余治療組間差異比較無統計學意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠肝組織中TNF-α、iNOS的基因轉錄水平比較（±s）

表4 各組大鼠肝組織中TNF-α、iNOS的基因轉錄水平比較（±s）

組 別 n正常組 10模型組 4陽性對照組 5中藥組 5干細胞組 6聯合組 7 TNF-α iNOS 1.01±0.17 1.00±0.11 3.18±0.20* 5.99±0.86*2.65±0.34*△▲ 4.13±0.36*△▲2.60±0.28*△▲ 3.93±0.64*△▲2.31±0.40*△▲ 3.53±0.95*△▲1.49±0.12*△ 1.80±0.24*△

圖3 各組大鼠肝組織PCR電泳結果

3 討 論

研究發現［10]，急性肝衰竭導致肝細胞大量壞死，內環境紊亂促進各種炎癥因子釋放，致內毒素血癥形成是其早期主要的病理機制。其治療重點在于減少細胞壞死及炎癥因子，減輕肝臟炎癥反應，避免加重內毒素血癥。

NF-κB是介導細胞內炎癥反應最重要的通路之一，活化后的NF-κB誘導大量炎癥因子的合成，引起炎癥過度化與重癥化［11-12]。肝衰竭發生時，其下游炎癥因子如TNF-α、iNOS、IL-1等大量合成釋放，加重肝臟損傷，且進一步促進NF-κB的激活，形成惡性循環，最終導致肝內爆發性炎癥失控，使肝臟合成、代謝及解毒功能發生嚴重障礙［13]。當TNF-α大量分泌時，誘導產生內毒素血癥，可對肝細胞造成嚴重損傷［5，14]。且TNF-α不僅介導炎癥反應，其還可與FAS死亡受體結合，激活凋亡起始物Caspase-8，進而誘導細胞凋亡［15]。當受到內毒素、TNF-α等刺激后，iNOS表達迅速升高，通過干擾肝臟生物轉化及線粒體毒性、損傷DNA、誘導肝細胞凋亡等途徑參與肝臟炎癥損傷［16]。

由于干細胞在細胞修復、再生方面具有獨特的優勢，且骨髓來源的干細胞具有免疫原性低，易于獲得和培養等優點，目前已將其應用于急慢性肝病的治療，干細胞不僅能夠提高爆發性肝衰竭的生存率，還可以促進受損肝細胞增殖，抑制肝細胞凋亡［6-7]。

茵陳四苓顆粒為本院自制，由四川省名老中醫孫同郊教授經驗方所成。方中重用茵陳為君，取其清熱利濕退黃之功，大黃、赤芍為臣藥，涼血化瘀，佐以茯苓、白術補中健脾，全方以清泄為主，攻補兼施，共奏清熱解毒化瘀扶正之效。臨床研究顯示，茵陳四苓顆粒在治療重型肝炎中表現出改善肝功能、提高凝血酶原活動度等功效［17]，動物實驗證實［18]，茵陳四苓顆粒明顯降低急性肝損傷大鼠的轉氨酶及血漿ET水平，表明其在調節重肝大鼠炎癥反應方面有一定作用。

本實驗通過TAA灌胃成功建立急性肝衰竭大鼠模型，通過復方甘草酸苷片、茵陳四苓顆粒、單純干細胞和茵陳四苓顆粒聯合干細胞等治療方法，發現各治療組均能有效降低AST、ALT及血漿ET水平，且聯合組效果優于其他治療組。為進一步探索相關機制，本實驗測定了炎癥信號通路NF-κB的表達及其下游炎性因子TNF-α、iNOS的基因轉錄。結果證明單純中藥治療、干細胞干預、二者聯合治療均能降低NF-κB的表達、減少TNF-α、iNOS的基因轉錄，有效控制肝內失控性炎癥反應、保護肝臟功能。聯合組療效優于各單純治療組，表明茵陳四苓顆粒聯合干細胞治療可能通過介導炎癥通路、清除內毒素及炎性介質等作用，促進干細胞的分泌，增強干細胞的修復增殖及抗凋亡能力。清熱解毒涼血化瘀切中急性肝衰竭的主要病理環節，以其為治療大法而成的茵陳四苓顆粒可以為干細胞治療急性肝衰竭提供新的聯合手段，二者聯合亦可為急性肝衰竭的治療提供新的思路。