艾灸對應激性潰瘍模型大鼠血清和下丘腦中GAS、SS表達的影響

付晨露 馬佳佳 關翰宇 李婧婷 王旒靖 薛 婷 吳穎琦 邵一軒 馬惠芳△

（1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.北京市順義區空港醫院，北京 101300；3.中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053）

應激性潰瘍（SU）是指機體在應激狀態下（如訓練比賽、長跑等）發生的以炎癥糜爛、淺表性潰瘍及胃腸道出血為特征的急性胃黏膜病變［1]，是臨床上急診ICU患者常見并發癥之一［2]。目前對SU的機制研究尚未完全明了，近年來隨著神經胃腸病學研究的不斷深入，眾多研究表明，消化系統疾病的發生發展與腦腸軸中腦腸肽水平變化密切相關，而胃泌素（GAS）、生長抑素（SS）是與胃腸疾病相關的重要腦腸肽［3-4]。前期實驗研究已證明針刺足三里、中脘可通過調控腦腸軸起到治療SU作用，而關于艾灸足三里、中脘的研究較少，因此本實驗以SU模型大鼠為對象，艾灸為干預手段，觀察大鼠血清及下丘腦中GAS、SS含量的變化，探討艾灸對治療SU的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級7周SD雄性大鼠28只，體質量180～200 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號：SCXK（京）2009-0017。大鼠飼養于北京中醫藥大學實驗動物中心SPF級動物房內，控制環境溫度為（22±2）℃，相對濕度 55%～65%，明/暗周期（L/D）為 12 h/12 h，光照時間為 7∶00～19∶00（ZT0-ZT12）。大鼠可自由進食、飲水。實驗操作嚴格參照《關于善待實驗動物的指導性意見》［5]，并已通過北京中醫藥大學動物倫理審查委員會審查。

1.2 試藥及儀器

1）試劑：多聚甲醛（鼎國昌盛生物技術有限公司，編號AR-0221）、無水乙醇、二甲苯（北京化工廠）、蘇木精染料、伊紅染料（東勝泰博科技公司）、GAS酶聯免疫檢測試劑盒（EIA-2535）、大鼠SS酶聯免疫檢測試劑盒（ML-ELISA-A10956，均購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）；戊巴比妥鈉（Sigma公司生產，貨號P3761）、奧美拉唑腸溶膠囊（阿斯利康制藥有限公司生產，批號H20030413）。2）儀器：ZK 38型低溫離心機（德國Eppendor公司制造）、LEICAEG1150C切片機（德國萊卡制造）；OLYMPUS顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社制造）、OLYMPUS Hyper LCD相機（日本索尼制造）、標準規格酶標儀（Thermo Scientific制造）、自貼式艾炷（高0.8 cm，直徑0.7 cm，中研太和有限公司）。

1.3 造模方法

SD大鼠予相同環境飼養。并按隨機數字表法將大鼠分為空白組、模型組、艾灸組、藥物組，每組各7只。除空白組外，其余3組選用RWIS的改良辦法［5]復制SU模型。造模大鼠禁食不禁水36 h后放入自制大鼠固定器（350 mL塑料礦泉水瓶，去瓶蓋，剪開距瓶底5 cm處，將大鼠從瓶底剪開處放入，固定瓶底），將瓶身直立浸入溫度約 （20±1）℃的水中，浸泡3 h后取出，造模成功。造模后第3天，除空白組外其余各組重復上述造模過程再行治療。

1.4 干預方法

穴位定位參照《實驗針灸學》［6]，其中足三里位于膝關節后外側，在腓骨小頭下約5 mm，雙側選穴；中脘位于臍上約20 mm。參考相關文獻［7-8]，將艾灸組大鼠仰臥位束縛于鼠板上，用自貼式小艾炷灸雙側足三里穴及中脘穴，觀察大鼠肢體反應，以其安靜耐受為度，每穴連續灸3壯?？瞻捉M及模型組大鼠每日用同樣的方法進行束縛固定，但不進行艾灸治療。藥物組大鼠每日予奧美拉唑溶液2 mL灌胃 （用蒸餾水溶解奧美拉唑腸溶膠囊粉末，質量濃度為0.02 mg/mL），所有組皆在造模后第1天開始治療，連續5 d。

1.5 標本采集與檢測

實驗結束后，將大鼠用2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔麻醉，快速取血、取胃、取腦。

1.5.1 胃黏膜損傷指數測定 取血后結扎大鼠賁門和幽門，向胃內注入10%多聚甲醛固定液10 mL，將全胃取下，置于固定液中10 min后取出，沿胃大彎剪開，用0.9%氯化鈉注射液沖去胃內容物，鋪于平板上，充分暴露潰瘍，按Guth［9]標準記錄即按照黏膜病變長度計算：斑點糜爛為1分；糜爛＜1 mm為2分；1～2 mm為3分；2～3 mm為4分；＞3 mm為5分；寬度＞2 mm時分值×2，最后將所得分相加即為潰瘍指數（UI）。

1.5.2 HE染色觀察胃組織形態學 取含潰瘍灶的胃組織，約5 mm×5 mm大小，放于10%多聚甲醛液中進行固定，石蠟包埋，切片厚約5 μm，隔1張取1張，每個標本取4張，隨后進行HE染色，切片經二甲苯脫蠟后，酒精下行入水，用流水沖洗3 min后用蘇木素復染10 min，再用流水沖洗15 min，隨后用鹽酸酒精分色30 s，然后流水蓄化15 min，再用伊紅溶液復染10 min，最后酒精上行脫水，二甲苯透明30 min，封片結束。光學顯微鏡下觀察。

1.5.3 血清GAS、SS的含量檢測 以腹腔主動脈采血5 mL，分離血清，保存于-80℃冰箱備測，按照酶聯免疫試劑盒說明書進行，測定各孔的吸光度值，計算出樣品濃度。

1.5.4 下丘腦GAS、SS含量檢測 大鼠斷頭后迅速在冰上取腦，剝離出下丘腦，稱質量，勻漿，勻漿后放入離心機中，4℃，3 000 r/min，15 min。取上清，放入-80 ℃冰箱中待測，按照酶聯免疫試劑盒說明書進行，測定各孔的吸光度值，計算出樣品濃度。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠胃黏膜損傷指數UI比較

見表1。與空白組相比，其余3組大鼠的胃黏膜損傷指數明顯升高（P＜0.01）。與模型組相比，艾灸組和藥物組大鼠的胃黏膜損傷指數顯著降低 （P＜0.05或P＜0.01）。與藥物組相比，艾灸組大鼠的胃黏膜損傷指數一定程度降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠胃黏膜損傷指數UI比較（分，±s）

表1 各組大鼠胃黏膜損傷指數UI比較（分，±s）

與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同

組 別 n UI空白組 7模型組 7艾灸組 7 0±0 50.86±17.88*20.43±8.77*△△藥物組 733.00±8.81*△

2.2 各組大鼠胃黏膜形態學的光鏡下觀察結果

見圖1。空白組大鼠胃黏膜上皮完整，結構清楚，黏膜腺體整齊排列，未見紅細胞滲出。模型組大鼠黏膜上皮缺損，腺體紊亂或被破壞，黏膜充血，可見大量紅細胞滲出，胃黏膜細胞腫脹。艾灸組大部分胃黏膜結構較為正常，上皮較完整，紅細胞滲出較少，偶見少量細胞壞死。藥物組胃黏膜結構基本完整，細胞輕度水腫，紅細胞滲出較少。

圖1 各組大鼠胃黏膜組織（HE染色，200倍）

2.3 各組大鼠血清和下丘腦中GAS含量比較

見表2。與空白組相比，模型組的大鼠血清和下丘腦中GAS含量均升高（P＜0.01）。與模型組相比，艾灸組和藥物組大鼠的血清和下丘腦中GAS含量均降低（P＜0.01）。與藥物組相比，艾灸組大鼠的血清和下丘腦中GAS含量略降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠血清和下丘腦中GAS含量比較（ng/L，±s）

表2 各組大鼠血清和下丘腦中GAS含量比較（ng/L，±s）

組 別 n 血清GAS 下丘腦GAS空白組 7 36.39±1.95 55.02±8.52模型組 7 47.22±3.05* 66.28±3.97*艾灸組 7 29.65±2.55△△ 48.16±3.67△△藥物組 7 30.88±2.17△△ 48.79±5.35△△

2.4 各組大鼠血清和下丘腦中SS含量比較

見表3。與空白組相比，模型組大鼠的血清和下丘腦中SS含量均降低（P＜0.05）。與模型組相比，艾灸組及藥物組大鼠的血清和下丘腦中SS的含量均明顯升高（P＜0.01）。與藥物組相比，艾灸組大鼠的血清和下丘腦中SS含量無明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠血清和下丘腦中SS含量比較（ng/L，±s）

表3 各組大鼠血清和下丘腦中SS含量比較（ng/L，±s）

組 別 n 血清SS 下丘腦SS空白組 7 64.20±4.24 101.17±6.44模型組 7 51.72±6.62* 88.70±10.73*艾灸組 7 78.35±8.79△△ 124.07±10.89△藥物組 7 81.70±15.77△△ 119.73±6.47△△

3 討 論

灸法作為中醫三大療法之一，具有激發人體正氣，預防疾病，強壯補虛的功效。《扁鵲心書》說“人于無病之時，常灸關元、氣海、命關（食竇穴）、中脘……雖未得長生，亦可保百余年壽矣”。現代研究也表明［10]，艾灸具有鎮痛、改善血循環、調節免疫防御功能、調節代謝紊亂和臟腑功能作用。中醫認為本病歸屬于胃脘痛、嘈雜、痞證等范疇，治療應和胃止痛?！白闳铩睘樽汴柮魑附浐涎?，又為胃之下合穴，“合治內府”?！爸须洹睘槲钢佳ǎ夏枷嗯洌沧嗌褰禎?，健脾和胃，行氣止痛之功，研究表明［11]艾灸足三里、中脘可促進大鼠胃黏膜損傷的修復，起到保護胃黏膜作用。本實驗研究結果顯示艾灸組及藥物組大鼠胃黏膜UI均降低，說明艾灸足三里、中脘可起到與口服奧美拉唑腸溶片相同的療效，能夠盡快修復胃黏膜損傷，且光鏡結果亦顯示艾灸組及藥物組胃黏膜上皮細胞排列較為整齊，紅細胞浸潤程度降低，說明艾灸足三里及口服奧美拉挫腸溶片具有良好的修復效果，與之前研究結果一致。

研究表明［12]SU的發生與胃酸分泌增加、胃腸道黏膜屏障保護功能減低及神經內分泌功能失調相關。腦腸軸是將認知和情感中樞與神經內分泌、腸神經系統和免疫系統相聯系的雙向交通通路，是能在不同層次將胃腸道與中樞神經系統聯系起來的神經-內分泌網絡，機體通過神經-內分泌網絡對胃腸功能進行的雙向調節稱之為腦腸互動［13]，腦腸肽在腦腸軸各個環節中起著重要的調控作用，而分布于中樞神經系統和胃腸道中的腦腸肽，調控著胃腸運動、感覺、分泌、吸收等復雜功能，若機體長期處于應激狀態，會導致神經內分泌免疫失調，表現為腦腸互動、腦腸肽分泌異常［14]。本實驗選GAS、SS為參考指標，其中GAS是最強的促胃酸分泌激素［15]，主要由胃竇及十二指腸黏膜的G細胞分泌的一種多肽類激素，主要作用是促進胃酸、胃蛋白酶分泌，促進胃腸道黏膜生長，若胃泌素水平過高，使胃酸過度分泌，可破壞胃黏膜保護屏障，引發潰瘍或減慢潰瘍的愈合速度［16]。 趙輝［17]研究發現腦外傷并發應激性潰瘍患者血清GAS水平升高，予抗潰瘍治療后，GAS水平顯著降低；SS主要分布于腸神經系統、胃體和胃黏膜內的D細胞中，對胃腸道有廣泛抑制作用。在胃中，SS可以通過G蛋白介導直接作用于制酸的壁細胞從而減少胃酸分泌，也可通過抑制5-HT、胃饑餓素、組胺水平從而間接減少胃酸［18]，促進黏膜修復。王美林［19]研究表明，抗潰瘍治療后，SS 水平升高，GAS 水平降低，兩者數值的平衡在促進潰瘍修復中發揮重要作用，由此可見GAS和SS可通過相互作用調節胃酸分泌。本實驗研究結果顯示束縛-浸水法造模后，大鼠血清及下丘腦中的GAS水平明顯升高、SS水平顯著降低，提示腦腸肽水平、腦腸互動出現異常，經艾灸及奧美拉唑腸溶片治療后GAS水平明顯降低，SS水平顯著升高，提示艾灸“足三里”及“中脘”或服用奧美拉唑腸溶片可以調節腦腸肽水平，使腦腸互動恢復正常。

綜上所述，本實驗從觀察胃黏膜損傷指數UI，HE染色紅細胞滲出程度及血清與下丘腦中胃泌素和生長抑素水平的變化，證實了艾灸足三里、中脘穴可對應激性潰瘍大鼠起到良好的治療效果，其機制可能是通過調節腦腸肽水平的動態平衡，調控腦腸軸，從而使胃腸運動恢復正常，胃黏膜損傷得以恢復。