Hpd基因修飾制備高酪氨酸血癥III型巴馬小型豬模型

顧 鵬，陳傍柱，徐 濤，劉 聞，鄧俊成，徐名襯， 袁 進，陳恩生，顧為望，4*

(1. 南方醫科大學比較醫學研究所暨實驗動物中心，廣州 510515；2. 東莞松山湖明珠實驗動物科技有限公司， 廣東 東莞 523808；3. 南方醫科大學中西醫結合醫院，廣州 510315；4.五邑大學，廣東 江門 529020)

4-羥基苯丙酮酸氧化酶(4-OH phenylpyruvate dioxygenase，4HPPD/HPD)作為一種參與大多數生物體內酪氨酸分解代謝第二步所需的酶，存在于哺乳動物的肝和腎中，能夠將4-羥基苯丙酮酸轉化為尿黑酸(圖1)[1-2]。在III型酪氨酸血癥(Mckusick 27671)中，該酶活性低甚至不存在，臨床上主要表現為血清酪氨酸水平和尿液4-羥基苯丙酮酸、4-羥基苯乳酸、4-羥基苯乙酸水平顯著升高。患者通常會出現神經異常、智力遲鈍和輕度共濟失調，但尚未確定一致的表型[3]。越來越多的人開始關注這種疾病以及HPD阻滯的后果。本研究擬通過敲除Hpd基因建立高酪氨酸血癥III型巴馬小型豬模型，為更好地研究該疾病的本質和治療方法提供可靠的大動物模型。

圖1 酪氨酸代謝通路及其相關疾病Figure 1 Tyrosine catabolic pathway and related diseases

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

6頭巴馬小型豬，普通級飼養，其中2頭作為代孕母豬(24月齡)，體重40 kg；4頭作為供卵母豬(12月齡)，體重30～35 kg，均由南方醫科大學實驗動物中心提供并飼養[SCXK (粵) 2016-0041]，采卵和胚胎移植手術在南方醫科大學實驗動物中心大動物手術室進行[SYXK (粵) 2016-0167]。實驗動物飼養和實驗過程均按照實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷，所有手術操作均在麻醉狀態下進行，本研究經南方醫科大學倫理審查委員會審核通過(L2016088)。

1.1.2 載體

sgRNA載體pGL3-U6-gRNA-PGK-puromycin和Cas9載體pST1374-NLS-flag-linker-Cas9均購自Addgene。載體經轉化后提取質粒，通過酶切鑒定并進行測序分析，均正確后用作體外轉錄模板。

1.2 主要試劑與儀器

sgRNA體外轉錄試劑MEGAshortscriptTMKit(AM1354)和Cas9體外轉錄試劑mMESSAGE mMACHINE?T7 Ultra Kit (AM1345)均購自Ambion；酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1(PH>7.8)(P1012)抽提試劑購自北京索萊寶科技有限公司；X5高保真DNA聚合酶 (MF003)購自聚合美生物科技有限公司； 2× Taq PCR Master Mix (DBI-2028)購自DBI Bioscience；基因組DNA提取試劑盒TIANamp Genomic DNA kit(DP304-03)購自TIANGEN BIOTECH(BEIJING)；TA克隆試劑pMD19-T Vector Cloning Kit (T6013)購自大連Takara公司；四烯雌酮購自北京科益豐生物技術發展有限公司。顯微操作系統TransferMan NK2購自Eppendorf公司；倒置顯微鏡及成像系統購自Olympus公司；體視顯微鏡購自Nikon公司，拉針儀、磨針儀、鍛針儀毛細玻璃管均購自日本Narishige公司；細胞培養皿購自Corning公司；胚胎培養箱購自Thermo公司；胚胎移植管購自北京比威克生物公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 SgRNA-Hpd和Cas9 mRNA獲取

通過GeneBank網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)查找豬Hpd基因組序列。利用CRISPR設計網頁(http://crispor.tefor.net)于豬Hpd基因第6號外顯子上(E6)設計20 bp的靶向序列，并合成兩條互補的單鏈oligos。退火形成雙鏈后連接到pGL3-U6-gRNA-PGK-puromycin載體的Bsa I位點。以上述產物為模板通過X5高保真DNA聚合酶進行PCR擴增，完成sgRNA體外轉錄所需的模板制備。sgRNA-Hpd正向引物：5’-TTAAT ACGACTCACTATAGAGTGAAGGACATTGCGTTCG-3’；sgRNA-Hpd反向引物；5’-AAAAGCACCGAC TCGGTGCC-3’。sgRNA模板獲取PCR反應條件：98℃，5 min，98℃，30 s 60℃，30 s 72℃，30 s，37個循環，72℃，10 min，4℃保存。應用MEGAshortscriptTMKit試劑盒對上述體外轉錄模板進行體外轉錄獲得sgRNA-Hpd。用限制性內切酶AgeI 對Cas9載體pST1374-NLS-flag-linker-Cas9酶切線性化，用于Cas9 mRNA體外轉錄模板，應用Cas9體外轉錄試劑盒mMESSAGE mMACHINE?T7 Ultra Kit進行體外轉錄獲取Cas9 mRNA[4-5]。所有產物經酚氯仿抽提純化乙醇沉淀后回收并溶于無核酸酶的水中，-80℃保存備用。

1.3.2 巴馬小型豬同步發情與受精卵獲取

供卵母豬和代孕母豬均拌料飼喂給藥四烯雌酮20 mg/d，連續飼喂18 d誘導同步發情。停藥后，每天上午和下午，均在豬采食30 min后，通過壓背法和外陰觀察法檢測母豬的發情狀態，當母豬出現“靜立反射發情”時即可進行自然交配。12～14 h后通過手術沖卵方法收集巴馬小型豬豬受精卵。

1.3.3 Cas9 mRNA和sgRNA的受精卵胞質內共注射

用RNase-free water(胚胎水)將Cas9 mRNA和sgRNA-Hpd分別稀釋至100 ng/μL和50 ng/μL。隨后將混合物注射入巴馬小型豬單細胞期受精卵的胞質中，注射完成后放入培養箱培養30～60 min，挑選狀態良好的受精卵行胚胎移植。

1.3.4 胚胎移植及妊娠檢測

將選好的發情代孕母豬通過戊巴比妥鈉靜脈注射麻醉，手術切開下腹部一小口，找出一側子宮角和輸卵管傘部，將受精卵用胚胎移植管移植至一側的輸卵管中，每頭代孕母豬移植10枚受精卵。移植后19～21 d，用豬早孕檢測試紙檢測是否妊娠。

1.3.5 基因型鑒定

每頭F0代巴馬小型豬分別進行耳號標記并剪取少量耳組織，用基因組提取試劑盒TIANamp Genomic DNA kit提取基因組DNA。設計相應PCR引物擴增巴馬小型豬HPD基因6號外顯子(表1)，用TAQ酶進行PCR擴增目的片段。并將PCR產物用pMD19-T Vector Cloning Kit進行TA克隆。最后挑取10個單克隆，測序分析。

1.3.6 蛋白表達水平檢測

按照標準操作提取#3和#4巴馬小型豬肝組織全蛋白并進行濃度測定，取20 μg進行蛋白電泳。SDS-PAGE分離膠和濃縮膠分別按照濃度為10%和5%配置，電壓為恒壓80 V，30 min；120 V，60 min。電泳結束后切下目的蛋白與內參條帶，轉膜：恒定電流200 mA, 120 min。5% BSA溶液封閉1 h。一抗4℃孵育過夜(Anti-HPD antibody，ab232906)，TBST洗膜10 min×3次，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次?；瘜W發光儀顯影。

1.3.7 血液氨基酸檢測

(1)樣品采集：仔豬出生15 d后，將新鮮外周血采集后滴于專用采血濾紙上，自然晾干3 h，待完全干燥后放于封口塑料袋內，置于-20℃冰箱中保存待檢。

(2)樣品處理方法：本研究用血液氨基酸檢測儀器為美國生物應用系統公司(Applied Biosystems)3200QTRAP型串聯質譜儀。將干燥血液濾紙片用打孔器制成直徑為3 mm的圓形濾紙血片后置于96孔聚丙烯板中(高低各1各質控)。同時，向每孔加入甲醇溶液100 μL(含有同位素內標)，用Teflon膜覆蓋，置于45℃環境密封震蕩45 min，設置振蕩頻率為650 r/min。震蕩完畢后室溫放置20 min，轉移其中75 μL至新的96孔聚丙烯板并用鋁膜覆蓋，隨后即可上樣檢測[6]。

表1 巴馬小型豬HPD基因6號外顯子擴增引物

(3)數據分析：定量分析采用美國生物應用系統公司軟件ChemoView1.2(Applied Biosystems)，根據同位素內標及其相對應的離子峰強度，根據濃度已知的內標，即可自動計算出樣品中所含氨基酸的濃度。

1.3.8 尿液酪氨酸代謝產物檢測

(1)尿樣采集和預處理：通過仔豬代謝籠收集豬尿樣10 mL于15 mL離心管中，迅速置于-20℃冰箱保存待檢測。尿液樣本經3500 r/min離心10 min以去除雜質和蛋白質，并取上清測定尿肌酐值。

(2)樣品處理方法：將預處理樣品根據所測定肌酐值取0.2 mg肌酐量的尿液加入1 U/μL尿素酶共20 μL，置于37℃反應30 min后取出加入內標液和純水補足終體積為2 mL。然后依次加入5%鹽酸羥胺500 μL和2.5 mol/L 氫氧化鈉溶液400 μL混勻后于室溫靜置1 h。待反應完成后加入6 mol/L鹽酸350 μL終止反應并加入乙酸乙酯6 mL混勻，3500 r/min離心5 min取有機相至另一試管中并重復一次。加入無水硫酸鈉離心吸取上清液，于60℃恒溫用氮氣吹干樣本。向樣品中加入BSTFA+10%TMCS硅烷化試劑100 μL，置于80℃恒溫箱中30 min，衍生完成后待樣品冷卻即可取樣檢測。

(3)色譜及質譜條件：本研究所用氣相色譜-質譜聯用儀為日本島津GCMS-QP2010 ultra分析儀。色譜柱DB25(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)；進樣口溫度280℃；柱溫100℃持續4 min，以4℃/min的速率升溫至280℃，保持10 min，再以10℃/min升溫至300℃保持10 min；載氣：高純氦氣(99.999%)；氣體流速：43.0 cm/s，分流比20∶1；接口溫度280℃；離子源溫度：200℃；質譜掃面范圍：50～500 amu。數據分析軟件為GCMS Solution 4.11。

2 結果

2.1 sgRNA設計及Cas9 mRNA和sgRNA制備

sgRNA-Hpd設計位點如圖2所示。體外轉錄后經RNA電泳顯示其中sgRNA-Hpd片段大小為120 bp左右，Cas9 mRNA片段大小為4300 bp左右。表明成功制備了Cas9 mRNA和sgRNA-Hpd。

2.2 受精卵胞質內共注射Cas9 mRNA和sgRNA建立HPD基因修飾巴馬小型豬

將20枚巴馬小型豬的單細胞期受精卵予以胞質內顯微共注射Cas9 mRNA和sgRNA-Hpd(圖3)。移植至2只代孕母豬。2只代孕母豬懷孕，共出生2窩，獲得F0代巴馬小型豬共4只，公母比例為2∶2(表2)。

2.3 基因型鑒定

TA克隆的測序結果如表3所示。測序結果顯示4頭F0代中1只為野生型，Hpd基因未發現有突變，與野生型巴馬小型豬的Hpd基因序列完全一致。其余3頭F0代巴馬小型豬在sgRNA-Hpd所介導定位的Hpd基因位點上出現了隨機刪除或插入若干個堿基(表3)。結果表明，F0代巴馬小型豬Hpd基因突變位點具有長度可變或堿基對替換數目可變的特點。這些DNA序列的變化通常導致編碼區域的截斷或編碼框架移位，從而導致Hpd基因功能障礙。

圖2 sgRNA-Hpd設計位點Figure 2 The design sites of sgRNA-Hpd

表2 F0代巴馬小型豬出生情況對比

表3 F0代仔豬Hpd基因突變

注：WT：野生型；“△”：堿基刪除；“+”：堿基插入。

Note. WT: wild type; “△”: base deletion; “+”: base insertion.

圖3 豬受精卵胞質內共注射Cas9 mRNA和sgRNA-Hpd與F0代巴馬小型豬Figure 3 F0 generation of newborn Bama minipig pups with HPD gene mutations generated by CRISPR/Cas9 system zygote injection

圖5 血液酪氨酸代謝水平Figure 5 Metabolic profile of the tyrosinemia type III Bama minipigs

2.4 HPD蛋白表達

Western blot檢測結果如圖4所示，未發生Hpd基因敲除的巴馬小型豬(#4)與野生型巴馬小型豬相比，肝組織HPD蛋白表達量未發生任何改變；相反，#3巴馬小型豬由于Hpd基因敲除后，肝組織HPD蛋白則完全沒有表達。

圖4 HPD蛋白表達水平Figure 4 The relative expression of HPD protein

2.5 血液酪氨酸水平

血液酪氨酸檢測結果顯示，和野生巴馬小型豬血液酪氨酸水平相比，#1、#2、#3巴馬小型豬發生Hpd基因敲除后血液酪氨酸水平明顯上升，均達到1200 μmol/L以上；相反，由于酪氨酸水平上升，苯丙氨酸處于正常水平，苯丙氨酸和酪氨酸比值(Phe/Tyr)在發生Hpd基因敲除巴馬小型豬(#1、#2、#3)中顯著降低。見圖5。

2.6 尿液氨基酸代謝產物含量

顯著升高的尿液4-羥基苯乳酸和4-羥基苯乙酸水平是高酪氨酸血癥III型的重要臨床特征。通過基因型鑒定我們已確認#1和#2巴馬小型豬模型成功敲除Hpd基因，通過氣相色譜-質譜分析檢測尿液酪氨酸代謝產物水平結果顯示，與野生型巴馬小型豬相比，#1和 #2巴馬小型豬尿液4-羥基苯乳酸和4-羥基苯乙酸水平明顯上升。見圖6。

圖6 尿液酪氨酸代謝產物Figure 6 Urinary excretion of tyrosine metabolites

3 討論

血液酪氨酸水平的升高和尿液4-羥苯丙酮酸及其衍生物的增加常被認為是遺傳性酪氨酸血癥的顯著特征。本研究利用CRISPR/Cas9技術靶向編輯巴馬小型豬Hpd基因成功制備了高酪氨酸血癥III型巴馬小型豬模型。通過基因型鑒定確認了其中3只巴馬小型豬的Hpd基因發生敲除，1只未發生敲除，整體敲除效率達到75%。為檢測是否存在脫靶效應，我們將外顯子序列中與sgRNA-Hpd匹配達到15 bp以上基因序列作為潛在可能的脫靶位點。經PCR擴增后送樣進行Sanger測序，所有檢測的潛在脫靶位點均未發生突變，所以我們猜想，#4巴馬小型豬未發生突變可能的原因是因為顯微注射未成功或是sgRNA-Hpd未成功打靶。為進一步確認其表型，我們通過Western blot結果發現，敲除Hpd基因后巴馬小型豬肝組織HPD蛋白完全不表達，通過檢測巴馬小型豬的血液氨基酸濃度，發現Hpd基因敲除的3只巴馬小型豬酪氨酸濃度顯著升高；進一步我們通過氣相色譜檢測尿液酪氨酸代謝產物發現Hpd基因敲除巴馬小型豬的尿液4-羥基苯乳酸和4-羥基苯乙酸水平顯著上升，這與人類III型酪氨酸血癥的臨床特征一致(Endo等人1983)[7]。而僅僅是HPD酶活性缺乏似乎不會引起肝腎功能異常[8]。

可以預料，隨著串聯質譜法的使用越來越多，以及在新生兒篩查項目中納入酪氨酸測量，持續高酪氨酸水平的無癥狀嬰兒數量將越來越多。根據本文提供的數據，巴馬小型豬高酪氨酸血癥III型模型可作為人類III型酪氨酸血癥的理想的模型。這一新的基因敲除巴馬小型豬遺傳性酪氨酸血癥可以用來深入了解4-羥基苯丙酮酸氧化酶在遺傳性酪氨酸血癥中的作用，為更好地研究和治療酪氨酸代謝相關疾病奠定基礎。