CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)Slc6a6基因敲除大鼠的繁殖與鑒定

仝慧慧，齊浩銘，王 辰，莫麗冬，范維佳，徐立霞，么秀華， 夏一鳴，黃慧玲*

(1. 天津醫(yī)科大學(xué)，天津 300070；2. 天津市環(huán)湖醫(yī)院，天津市神經(jīng)外科研究所， 天津市腦血管與神經(jīng)變性重點實驗室，天津 300350)

牛磺酸(taurine，Tau)是一種含硫氨基酸，能調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，防止細(xì)胞內(nèi)鈣超載，減少自由基產(chǎn)生，改善細(xì)胞膜的通透性，防止細(xì)胞腫脹變形[1-2]，是嬰兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育期間的重要營養(yǎng)因子，有增強突觸傳遞，緩解中風(fēng)、癲癇、神經(jīng)退行性疾病癥狀等神經(jīng)保護(hù)作用[3-4]。Tau主要是由細(xì)胞膜上的牛磺酸轉(zhuǎn)運體(taurine transporter，TauT，Slc6a6，序列參考號：NC_005103.4)轉(zhuǎn)運至細(xì)胞內(nèi)，以維持細(xì)胞內(nèi)Tau的高濃度，TauT是由621個氨基酸殘基組成的大小約74×103的蛋白質(zhì)，包含12個跨膜螺旋區(qū)。在急性損傷發(fā)生后，細(xì)胞內(nèi)的Tau可調(diào)節(jié)腦細(xì)胞滲透壓，改善神經(jīng)元腫脹。本課題組前期實驗證實，顱腦創(chuàng)傷后，腦水含量和水通道蛋白4的表達(dá)升高,Tau可以使其下調(diào)，改善神經(jīng)元損傷等[5]。

為研究Tau缺乏對機體的影響，研究人員通常選用補充TauT抑制劑如β-丙氨酸等干擾Tau吸收的方法制作動物模型，但是這種一過式的抑制牛磺酸攝入的方法，短暫且不穩(wěn)定，故急需一種更穩(wěn)定有效的方法構(gòu)建該動物模型。近幾年發(fā)展的CRISPR/Cas9技術(shù)可以敲除特定基因位點，有靶向精確度高、實驗周期短，無物種限制，且比ZFN、TALEN技術(shù)易操縱[6-8]等優(yōu)勢，得以推廣。

本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，首次建立Slc6a6基因敲除大鼠模型(TauT-/-大鼠)，并進(jìn)行繁殖和鑒定，為進(jìn)一步研究Tau對大鼠神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型的影響，提供可靠而穩(wěn)定的基因工程模型，為闡明Tau對相關(guān)疾病的治療作用等探究工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本實驗所需野生型大鼠均選用SPF級SD大鼠，體重240～260 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK (京) 2014-0004]；TauT+/-大鼠委托中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所構(gòu)建，得到F0代2只(雌雄各1只)[SCXK京2013-0002]，本課題組對TauT+/-大鼠進(jìn)行飼養(yǎng)、配籠繁殖，并對純合TauT-/-大鼠進(jìn)行鑒定篩選，Slc6a6基因表達(dá)鑒定實驗所用大鼠：純合子(TauT-/-大鼠)、陰性(TauT+/+大鼠)、野生型大鼠(WT大鼠)均為2月齡SPF級雄性大鼠，每組各6只，體重240～260 g。飼養(yǎng)和繁殖均在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所屏障環(huán)境中進(jìn)行[SYXK (津) 2014-0002]，其溫度、相對濕度、換氣次數(shù)、明暗周期等均符合中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)(GB14925-2010)。本研究中涉及的全部動物實驗方案,均參考中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實驗動物倫理委員會有關(guān)實驗動物使用的相關(guān)規(guī)定，滿足實驗動物福利要求，并遵照實驗動物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。相關(guān)動物實驗倫理審查證明編號為:DWLL-20180916和DWLL-20180917。

1.2 主要試劑與儀器

Cas9 mRNA合成試劑盒T7 Ultra kit (美國Ambion公司，AM1345)、sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄試劑盒MEGA shortscript Kit (美國Ambion公司，AM1345)、EasyPure Genomic DNA kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司，EE101-12)、Genstar 2× Taq PCR StarMix with Loading Dye(深圳輝諾生物科技有限公司，A112-10)、RNA simple Total RNA kit、RT-PCR kit(天根生化科技(北京)有限公司，DP419、KR118、FP205)，DAB顯色劑(美國Sigma公司，D8001)，TauT抗體(E-10)(美國Santa Cruz Biotechnology公司，sc-166640)，IgG抗體-Fab段-HRP多聚體(德國Leica公司，通用型)，兔抗小鼠辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗、β-actin二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，bs-10966R、ZB2301)，β-actin一抗(北京博奧森生物科技有限公司，bs-0061R)。顯微注射儀(日本尼康公司，TE2000U)、凝膠成像系統(tǒng)(英國Syngene公司，Gene Genius)、ABI一代測序儀(美國ABI公司，3500)、低溫高速離心機(美國Beckman公司，J2-21)、Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳系統(tǒng)、Mini Trans-Blot Cell型轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司，1658033、1703930)、熒光定量PCR儀(瑞士Roche 公司，LC480)、徠卡全自動免疫組化儀(德國Leica公司，BOND-Ⅲ)，顯微鏡(日本Olympus公司，BX3-CBH)。

1.3 實驗方法

1.3.1 TauT-/-大鼠的構(gòu)建和繁殖

TauT-/-大鼠模型，是采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，針對TauT基因第5外顯子，選擇2個不同sgRNA的作用靶點，合成兩對寡聚核苷酸鏈(Rat-Slc6a6-gRNA1-up：TAGGCCCCTTTGTCCCACAGAC和Rat-Slc6a6-gRNA1-down：AAACGTCTGTGGGACA AAGGGG；Rat-Slc6a6-gRNA2-up：TAGGGACAGACC CTGTCTCTGG和Rat-Slc6a6-gRNA2-down：AAACCC AGAGACAGGGTCTGTC)，經(jīng)退火，連入BsaI酶切回收的pUC57-sgRNA表達(dá)載體，同時構(gòu)建Cas9表達(dá)載體(pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，Addgene ID: 44758)。經(jīng)測序驗證構(gòu)建的載體序列無誤后，分別由DraⅠ、AgeⅠ酶切、抽提純化，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄獲得Cas9 mRNA和sgRNA，將其混合,調(diào)整濃度Cas9 mRNA(20 ng/μL) 和sgRNA(10 ng/μL)后，通過顯微注射法注射到SD大鼠受精卵的雄性胞核和細(xì)胞質(zhì)中，再植入假孕大鼠體內(nèi)，繁殖得到 founder 大鼠(F0 代)。

將F0代陽性大鼠與野生型SD大鼠合籠，得到F1代雜合子(TauT+/-大鼠)，再選擇F1代TauT+/-大鼠與野生型SD大鼠合籠以擴充體系，得到TauT+/-F2代大鼠，F(xiàn)2代TauT+/-大鼠自交后，得到TauT+/+，TauT+/-和Tau-/-三種F3代基因型大鼠。

1.3.2 基因組提取、擴增和測序

利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，將包括Slc6a6基因第五外顯子的共約390 bp的片段靶向敲除，通過基因型鑒定，分析新生大鼠的基因分型。將出生10-12 d左右的大鼠，采用剪趾法編號，并提取大鼠基因組DNA，經(jīng)PCR 擴增靶序列，鑒定所用上游引物：5’-TCATTGTCCTGTCCCCACTTCTT-3’，下游引物：5’-TCCTCATCTGACAGTTAAAGAATCTAAGG-3’。PCR的體系和條件參見Genstar試劑盒說明書。結(jié)果判斷依據(jù)：陰性TauT+/+是一條帶：702 bp，雜合子TauT+/-含有兩條帶，分別為702 bp和312 bp，純合子TauT-/-是一條帶：312 bp。

提取F1代TauT+/-、F3代TauT+/+和TauT-/-的基因組，經(jīng)PCR擴增，由上海生物工程公司測序后，再與F0代比對，以確定 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因敲除情況。

1.3.3 Real-time PCR檢測TauT-/-和TauT+/+大鼠腦組織中Slc6a6的表達(dá)

選取TauT-/-、野生型(WT)和TauT+/+大鼠雄性各6只，提取大腦組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄后，real-time PCR檢測Slc6a6 mRNA表達(dá)。Slc6a6基因引物序列：上游5’-GAGGTCATCATAGGCCAGTAC-3’；下游5’-GTACACATTCAGGAGGGACAC-3’，擴增產(chǎn)物為120 bp。以GAPDH為內(nèi)參：上游5’-AACTCCCATT CTTCCACC-3’；下游5’-ACCACCCTGTTGCTGTAG-3’。擴增產(chǎn)物為100 bp。PCR反應(yīng)體系：10 μL的2× SYBR Green Mix,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，1 μL的cDNA，補充ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸15 s，40個循環(huán),最后72℃延伸5 min。TauT、GAPDH的退火溫度分別是60℃和55℃。樣本目的基因的相對表達(dá)量計算公式為：相對表達(dá)量=2-△△Ct[△Ct=Ct1-Ct2；Ct1：樣品目的基因的臨界循環(huán)數(shù)；Ct2：樣品管家基因的臨界循環(huán)數(shù)。△△Ct=每組△Ct值-(對照組△Ct的平均值)]。

1.3.4 Western blot技術(shù)檢測TauT-/-和TauT+/+大腦組織中TauT蛋白表達(dá)

選取TauT-/-和TauT+/+大鼠雄性各6只，麻醉處死，提取大腦組織，勻漿后，提取并測定總蛋白濃度，等質(zhì)量上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，70 V,40 min，120 V,90 min。300 mA濕轉(zhuǎn)120 min,5%脫脂奶粉封閉2 h，加入Santa Cruz TauT一抗(1∶200)、β-actin一抗(1∶1000),4℃孵育過夜，次日洗膜，孵HRP標(biāo)記的二抗(1∶1000)常溫孵育2 h，洗膜3次。加入顯影劑，于成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集。樣本中目的蛋白的相對表達(dá)量是目的蛋白條帶與內(nèi)參β-actin 蛋白條帶灰度值的比值。

1.3.5 免疫組化檢測TauT-/-和TauT+/+大腦組織TauT蛋白的表達(dá)

心臟灌注TauT-/-和TauT+/+大鼠后,取腦組織，放入10%中性福爾馬林溶液，固定24 h之后，脫水，包埋制成蠟塊，4 μm切片，68℃烤箱烤片，再利用Leica BOND-Ⅲ全自動免疫組化儀進(jìn)行常規(guī)染色程序：脫蠟、水化、封閉、孵育TauT一抗 (1∶100)、沖洗、孵育二抗、沖洗、DAB染色、蘇木精復(fù)染，脫水透明、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察，圖像采集、分析結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠的構(gòu)建和繁殖情況

利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行目的基因敲除，使Slc6a6基因發(fā)生移碼突變，并提前產(chǎn)生了終止密碼子，使翻譯提前終止，造成蛋白功能障礙(圖1)。

歷時約15個月， F1和F2代共繁育出23窩，F(xiàn)1～F3代總計184只，F(xiàn)3代出現(xiàn)純合子，該代純合率約為20.59%。F3代TauT+/+：TauT+/-：TauT-/-的比例約為1∶2.57∶1.28，近似滿足孟德爾遺傳定律。繁殖過程中，成年鼠死亡14只，死亡率約為7.61%。F1～F3代大鼠繁殖情況見表1，多組F2代TauT+/-大鼠自交情況統(tǒng)計見表2。

2.2 基因型鑒定和測序結(jié)果

F0代TauT+/-大鼠與野生SD大鼠雜交，得到F1 代TauT+/-和TauT+/+大鼠，F(xiàn)1 代TauT+/-與野生大鼠雜交繼續(xù)擴充體系，F(xiàn)2后代TauT+/-自交，F(xiàn)3代出現(xiàn)TauT-/-大鼠。基因型鑒定結(jié)果如圖2： TauT-/-：一條帶，312 bp；TauT+/-：兩條帶，為702 bp和312 bp。TauT+/+/ WT：一條帶，702 bp。

測序比對結(jié)果顯示， TauT-/-或TauT+/-(包含的缺失鏈)的基因缺失位點，如圖3A。TauT-/-和TauT+/+大鼠序列比對和靶點敲除情況，如圖3B、3C。TauT+/+基因型大鼠和TauT-/-基因型大鼠序列相差約390 bp，缺失靶點上下游序列對應(yīng)一致。

由基因型鑒定和測序結(jié)果可知：包含TauT-/-大鼠的第5外顯子的390 bp堿基被敲除，并發(fā)生重組修復(fù)。

圖1 利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除Slc6a6第五外顯子的示意圖Figure 1 Schematic diagram of the knockout of the fifth exon of Slc6a6 by CRISPR/Cas9 technology

表1 F1～F3代大鼠繁殖情況

表2 F2代不同種群大鼠的繁育結(jié)果

注：M:DNA分子量標(biāo)記；2#F1：TauT+/-；C：空白對照；N：WT；孔道3、5、7：TauT-/-大鼠；孔道2、6：TauT+/+大鼠；孔道1、4：TauT+/-大鼠。圖2 部分大鼠基因型PCR鑒定結(jié)果Note. M, DNA molecular weight marker; 2#F1, TauT+/-; C, Blank control; N, Wild type; Lanes 3, 5, and 7: TauT-/- rat; Lanes 2 and 6: TauT+/+ rat; Lanes 1 and 4: TauT+/- rat.Figure 2 Results of genotype identification of the rats by PCR

2.3 Real-time PCR檢測TauT-/-和TauT+/+大鼠腦組織Slc6a6的表達(dá)

TauT-/-大鼠和同窩TauT+/+大鼠腦組織Slc6a6 mRNA表達(dá)結(jié)果顯示：TauT-/-大鼠腦組織Slc6a6 mRNA幾乎不表達(dá)(如圖4C)。

注：A：TauT-/-大鼠測序結(jié)果，在“TTTG”堿基中間敲除了約390 bp；B: TauT-/-和TauT+/+大鼠序列比對結(jié)果，TauT-/-缺失390 bp；C:TauT+/+和TauT-/-大鼠堿基序列對比，矩形框區(qū)域為包含TauT第5外顯子的靶序列，劃線部分為Cas9核酸酶切割目的序列后重組修復(fù)隨機添加的序列。圖3 目的基因測序比對結(jié)果Note. A, The results of TauT-/- rat sequencing that have about 390 bp bases knocked out in the middle of “TTTG”. B, The results of TauT-/- and TauT+/+ rat sequence alignment: TauT-/- was missing about 390 bp. C, Base sequence comparison between TauT+/+ and TauT-/- rats: the rectangular box region is the target sequence containing the Tau5 exon 5 after Cas9 nuclease cleaves the sequence of interest. The underlined portion is the recombinantly added sequence.Figure 3 Results of target gene sequencing comparisons

2.4 Western blot技術(shù)檢測TauT-/-和TauT+/+大鼠腦組織TauT蛋白的表達(dá)

蛋白免疫印跡實驗結(jié)果表明，TauT-/-組大鼠大腦中TauT蛋白表達(dá)量與TauT+/+組大鼠相比，顯著降低(如圖4A、4B)。

2.5 TauT-/-和TauT+/+大鼠腦組織免疫組化結(jié)果

觀察TauT-/-大鼠和TauT+/+大鼠兩組皮層和海馬區(qū)TauT蛋白表達(dá)的情況。如圖5可見，TauT-/-大鼠的海馬和皮層區(qū)細(xì)胞膜上基本無TauT蛋白表達(dá)，而TauT+/+鼠的海馬和皮層區(qū)細(xì)胞膜上有TauT蛋白表達(dá)，表明Slc6a6基因的敲除導(dǎo)致TauT-/-大鼠腦組織TauT蛋白基本不表達(dá)。

3 討論

在研究人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面，大鼠與人更為接近，在生理、行為、代謝方面比小鼠更有優(yōu)勢[9]。大鼠廣泛被用于：獎勵和懲罰實驗、神經(jīng)官能癥等高級神經(jīng)活動的研究。由于構(gòu)建和繁殖基因敲除大鼠比小鼠困難，2010年才建立了第一個基于胚胎干細(xì)胞的p53基因敲除大鼠模型。據(jù)報道[10-12]：自2003年CRISPR/Cas9系統(tǒng)發(fā)明以來，已有超過30種不同的轉(zhuǎn)基因大鼠實驗?zāi)Ｐ捅挥糜谏窠?jīng)科學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)和癌癥等領(lǐng)域。目前，僅有關(guān)于TauT-/-小鼠模型的研究，對于Slc6a6基因敲除的大鼠模型及其有關(guān)的病理生理研究尚無文獻(xiàn)報道。

注：A: TauT-/-組與TauT+/+組TauT蛋白表達(dá)情況(n=6)；B:TauT-/-組與TauT+/+組TauT蛋白表達(dá)相對定量分析，*** P < 0.001(n=6)；C：TauT+/+組、WT組分別與TauT-/-組Slc6a6 mRNA表達(dá)相對定量分析比較，*** P< 0.001(n=6)。圖4 不同基因型大鼠腦組織TauT蛋白和Slc6a6 mRNA表達(dá)的情況Note. A, TauT protein expression in the TauT-/- and TauT+/+ groups (n=6). B, Relative quantitative analysis of TauT protein expression in the TauT-/- and TauT+/+ groups.***P< 0.001 (n=6). C, Slc6a6 mRNA expression in the TauT+/+ and WT groups was compared with the TauT-/- group.***P< 0.001 (n=6).Figure 4 Expression of Slc6a6 mRNA and TauT protein in the brains of different genotypes of rats

注：A、B、C：TauT+/+大鼠海馬(分別為× 40、× 100、× 200)；D、E、F：TauT-/-大鼠海馬(分別為× 40、× 100、× 200)；G、H、I：TauT+/+大鼠皮層(分別為× 40、× 100、× 200)；J、K、L：TauT-/-大鼠皮層(分別為× 40、× 100、× 200)。箭頭所示為TauT表達(dá)位置舉例。標(biāo)尺=20 μm。圖5 TauT-/-與TauT+/+鼠腦部皮層和海馬區(qū)附近的免疫組化結(jié)果比較Note. A, B, and C, the TauT+/+ rat hippocampus (× 40, × 100, and × 200, respectively). D, E, and F, the TauT-/- rat hippocampus (× 40, × 100, × 200, respectively). G, H, and I, the TauT+/+ rat cortex (× 40, × 100, × 200, respectively). J, K, and L, the TauT-/- rat cortex (× 40, × 100, × 200, respectively). The arrows show examples of TauT expression positions.Bars=20 μm.Figure 5 Comparison of immunohistochemistry results between TauT, TauT-/- and TauT+/+ rat brain, cortex, and hippocampus

本課題組委托中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，經(jīng)專業(yè)技術(shù)人員精心設(shè)計，選擇了具有較低脫靶概率的靶點，利用CRISPR/Cas9技術(shù)，基于Slc6a6的第5外顯子，構(gòu)建了TauT+/-大鼠模型。我們后續(xù)對TauT+/-大鼠進(jìn)行飼養(yǎng)、配籠繁殖、鑒定篩選出TauT-/-大鼠，該模型大鼠Slc6a6基因的第5外顯子被敲除，產(chǎn)生移碼突變，翻譯提前終止。基因型鑒定結(jié)果顯示：F3代的TauT-/-大鼠的電泳結(jié)果與最初引進(jìn)的TauT+/-大鼠電泳結(jié)果中的短鏈大小一致；同時，測序結(jié)果證實：TauT-/-大鼠的第5外顯子成功被敲除。F3代TauT-/-缺失的片段和F0代雜合子的短鏈缺失片段一致。從繁殖情況來看，TauT-/-大鼠出生后，能夠存活，為基因和蛋白水平的鑒定實驗提供了條件。F3代的TauT+/+：TauT+/-：TauT-/-三種基因型大鼠的比例約為1∶2∶1，符合孟德爾遺傳定律，因此該TauT-/-大鼠不具有胚胎致死性。初步統(tǒng)計，性別相同、月齡相近的TauT-/-大鼠比TauT+/+大鼠的體重低，這與Heller-Stilb等[13]發(fā)現(xiàn)TauT-/-小鼠的體重比野生小鼠低的結(jié)果一致。同期，觀察到少量TauT-/-大鼠有性情稍暴躁、行動稍遲緩等現(xiàn)象，對此我們會繼續(xù)保持關(guān)注。Ito等[13-14]通過同源重組技術(shù)敲除胚胎干細(xì)胞中TauT的第1或2-5個外顯子，構(gòu)建了TauT-/-小鼠，也發(fā)現(xiàn)TauT-/-模型小鼠體重降低，同時，心臟功能異常，運動能力降低[15-16]。Rikimaru等[17]也證明了TauT-/-大鼠線粒體的整體功能不如TauT+/+大鼠，關(guān)于TauT-/-大鼠線粒體功能受損情況，我們后期也將開展相關(guān)實驗研究。

本研究中RT-PCR實驗結(jié)果顯示：TauT-/-大鼠腦部Slc6a6 mRNA幾乎不表達(dá)，基因測序也顯示TauT第5外顯子完全敲除，其TauT蛋白表達(dá)量顯著低于TauT+/+大鼠，免疫組化結(jié)果顯示TauT-/-大鼠皮層和海馬區(qū)附近幾乎沒有TauT蛋白表達(dá)，表明Slc6a6基因敲除大鼠模型構(gòu)建成功。同時，海馬齒狀回區(qū)域細(xì)胞體積有收縮的現(xiàn)象，這可能與文獻(xiàn)所報道Tau可誘導(dǎo)小鼠海馬和紋狀體突觸傳遞增強有關(guān)[18]。.但本實驗中, TauT-/-組大鼠Western blot結(jié)果仍顯示有少量蛋白表達(dá)。推測產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因是不同抗原和抗體存在一定的交叉反應(yīng)(非目的蛋白可能含有能與目的蛋白抗體結(jié)合的抗原表位)：(1)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除了第5外顯子后，發(fā)生移碼突變，提前產(chǎn)生終止密碼子，造成翻譯提前終止，形成無功能的肽鏈或蛋白，相應(yīng)的肽鏈或蛋白可能會與原有完整蛋白的抗體產(chǎn)生非特異性結(jié)合；(2)理論上，敲除某個外顯子堿基序列后，剩余核酸序列若含有ATG等起始密碼子，其后的編碼序列還會翻譯出一段氨基酸序列，但這段序列不具備原有蛋白質(zhì)的功能[19-21]。無論是利用傳統(tǒng)的ES細(xì)胞打靶還是利用近些年發(fā)展起來的基因編輯手段，除非個別比較小的基因會選擇全基因敲除，大部分情況下，都是選擇上游的外顯子或特定的功能區(qū)域外顯子敲除，造成移碼突變或者是特定功能區(qū)喪失，用于研究基因缺失和功能的關(guān)系。

綜上，本研究應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定向敲除大鼠Slc6a6基因第5外顯子，成功構(gòu)建TauT-/-大鼠模型并穩(wěn)定遺傳，為探究牛磺酸預(yù)防和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的相關(guān)機制研究，提供良好的大鼠模型。