空腹與餐后條件下非洛地平緩釋片在健康人體內的藥代動力學比較研究

吳正宇，李相鴻，周理想，梁大虎，趙亞男,3

(1.皖南醫學院，安徽 蕪湖 241002；2.皖南醫學院第一附屬醫院弋磯山醫院，安徽 蕪湖 241001；3.安徽醫健領航醫藥科技有限公司，安徽 合肥 230031)

高血壓是世界上最常見的慢性疾病，也是心腦血管疾病、腎臟疾病和死亡最重要的危險因素，控制高血壓對心腦血管疾病的預防和管理至關重要，非洛地平(Felodipine，FLDP)是一種二氫吡啶類鈣通道阻滯劑，常用于治療高血壓和穩定型心絞痛[1-2]。非洛地平是BCS(生物藥劑學分類系統)Ⅱ類藥物，具有高滲透性、低溶解性的特點，制作成緩釋制劑具有優良的長效釋放特性，可減少病人服藥頻率[3-4]。非洛地平血漿濃度曲線會伴隨食物攝取受到強烈的影響，有研究發現薄荷醇、柚汁、葡萄汁、咖啡等會影響非洛地平的藥動學特征[5-6]。與食物一起攝入后，在胃近端混合不均勻會對藥物吸收產生影響，導致非洛地平的血漿峰值藥物濃度增加[7-8]。本試驗采用液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)法檢測人血漿中非洛地平的濃度，研究了空腹及餐后條件下非洛地平緩釋制劑的藥動學，比較了空腹與餐后條件下吸收與代謝特征，評價了進食對非洛地平藥代動力學參數的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器 UPLC20-AD超快速液相系統(島津公司)；AB Sciex Triple QuadTM AB SCIEX 5500 質譜(美國應用生物系統公司)。

1.2 試劑與試藥 非洛地平對照品(待測物，批號：100717-201403)來源中國食品藥品檢定研究院；非洛地平-d5對照品(內標物，批號：1037-147A1)來源于TLC Pharmaceutical Standards；甲醇(色譜純，Merck公司)，乙酸銨(分析純，Sigma公司)試驗用水為自制超純水，非洛地平緩釋片(Plendil，depottabletter)(規格：5 mg/片，阿斯利康(瑞典)制藥有限公司，批號：YCEN)。

1.3 給藥方法及血漿樣品采集 本試驗為隨機開放試驗，共納入受試者72名，其中36名受試者被隨機分至空腹組，在空腹條件下服用非洛地平緩釋制劑，男女均有，年齡為(28.3±6.1)歲，體重為(65.7±8.9)kg，服藥前禁食10 h過夜；另外36名受試者被隨機分至餐后組，在餐后條件下服用非洛地平緩釋制劑，男女均有，年齡為(29.5±6.15)歲，體重為(63.94±7.22)kg，禁食10 h過夜，服藥前半小時給予高脂餐。給藥前(0 h)及給藥后1、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、8、12、24、36、48、60 h取靜脈血4 mL，置抗凝管中，4 000 rpm離心5 min，取血漿于-70～-20 ℃冰箱儲存，用于血藥濃度檢測。非洛地平對光較敏感，樣品處理過程中應注意避光(黃光下操作)。試驗經過皖南醫學院弋磯山醫院倫理委員會批準，試驗地點為皖南醫學院弋磯山醫院Ⅰ期臨床試驗病房。試驗前所有受試者均簽署知情同意書。

1.4 色譜及質譜條件 使用LC-MS/MS法檢測血漿樣品中的血藥濃度。色譜柱：Luna C8色譜柱(5 μm，50 mm×2.0 mm)，C18預柱(4 mm×2.0 mm)；流動相：A 10 mmol·L-1乙酸銨水溶液，B甲醇；流速：0.6 mL·min-1，進樣時間：4.5 min；進樣量：5 μL，流動相洗脫流程見表1。離子源：電噴霧離子化(ESI)源，離子源噴霧電壓(IS)：5 000 V；離子源溫度(TEM)：500 ℃，氣簾氣(CUR)：20 psi；碰撞氣(CAD)：9 unit；離子源氣體1(GS1)：50 psi，離子源氣體2(GS2)：50 psi；檢測方式：多反應監測模式(MRM)；監測離子：338.1～384.3(非洛地平)，338.1～389.3(內標物，非洛地平-d5)；碰撞電壓(CE)：非洛地平與非洛地平-d5均為15 eV。

表1 流動相洗脫程序

1.5 溶液配制 非洛地平標準儲備液：精密稱取非洛地平對照品，用適量甲醇溶解，配制成濃度為1.00 mg·mL-1的非洛地平儲備液A，移取0.02 mL 非洛地平儲備液A加到19.98 mL甲醇中，混合均勻，配制成濃度為1.00 μg·mL-1的非洛地平儲備液B，移取1.00 mL非洛地平儲備液B加到9.00 mL甲醇中，混合均勻，配制成濃度為0.100 μg·mL-1的非洛地平儲備液C。非洛地平對照品工作液：分別取非洛地平儲備液A 0.02 mL，非洛地平儲備液B 5.00、4.50、4.00、2.50、2.00 mL，非洛地平儲備液C 5.00、2.50、0.50、0.30、0.20、0.10 mL，均添加甲醇至10 mL，配制成濃度為2 000、500、400、450、250、200、50.0、25.0、5.00、3.00、2.00、1.00 ng·mL-1的非洛地平對照品工作液。

非洛地平-d5(內標)標準儲備液：精密稱取非洛地平-d5對照品，同上操作，制備成濃度為1.00 mg·mL-1的內標儲備液A，濃度為1.00 μg·ml-1的內標儲備液B，濃度為0.100 μg·mL-1的內標儲備液C。非洛地平-d5工作液：與非洛地平工作液進行同樣操作，配制成濃度為2 000、500、400、450、250、200、50.0、25.0、5.00、3.00、2.00、1.00 ng·mL-1的非洛地平-d5工作液。

1.6 血漿樣品預處理 向固相萃取板 (C18E，25 mg )每個孔內加入0.8 mL甲醇溶液與0.8 mL 超純水，取500 μL樣品(空白樣品和內標空白樣品加500 μL空白人血漿)至96孔板(Plate-1)中；分別加入10 μL甲醇∶水(1∶1)，混合均勻，將樣品轉移至預處理的固相萃取板中，減壓抽干；向每個孔內加入0.8 mL超純水，減壓抽干，再加入0.8 mL超純水，減壓抽干；加入0.25 mL甲醇溶液，減壓抽干，將洗脫液均收集于新的96孔板(Plate-2)中，提交LC-MS/MS分析。

1.7 藥動學參數的計算 AUC0～t為0到相應時間的血藥濃度-時間曲線下面積，AUC0～∞為0到時間為無窮大的血藥濃度-時間曲線下面積，Cmax為最大血藥濃度，Tmax為達到最大血藥濃度時的時間，t1/2為消除半衰期，Vz為表觀分布容積，Cl為血漿清除率，ct為相應時間的血藥濃度。其中Cmax、Tmax、ct為實測值。使用Phoenix WinNolinon 6.4軟件，采用非房室模型計算藥動學參數。

1.8 累計吸收百分數的計算 使用Phoenix WinNolinon 6.4軟件擬合血藥濃度-時間數據，采用赤池(AIC)法判定房室模型，選用AIC最小的房室模型，依據房室模型判定結果選擇Wagner-Nelson法或Loo-Riegelman法計算各采血點時非洛地平的累計吸收百分數(Fa)。

1.9 統計分析 數據采用SAS 9.4軟件進行統計分析，Cmax與AUC經過對數轉換后進行分析，對于正態分布的資料采用兩樣本t檢驗，對于非正態分布資料采用秩和檢驗。P小于0.05時認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 血漿樣品檢測方法學驗證結果 本法測定時，非洛地平及非洛地平-d5的保留時間分別約為2.07、2.24 min。血漿中非洛地平、內標峰形良好，出峰位置無雜峰干擾測定。在濃度為0.02、0.04、0.1、0.5、1.0、5.0、9.0、10.0 ng·mL-1范圍內待測物濃度與待測物與內標物的峰面積比具有很好的線性關系，本方法測定非洛地平的標準的曲線方程為Y=0.547X+0.004 68(r=0.998 6)；Y為待測物與內標物的峰面積比，X為待測物濃度。配制濃度為0.6、4、8 ng·mL-1的血漿樣品，每個濃度進行6個樣本分析，每天測定一批，連續5 d，批間精密度分別為3.70%、0.99%、1.93%，批內精密度分別為2.31%、2.42%、3.57%；批間準確度分別為105.47%、106.20%、105.78%，批內準確度分別為105.75%、105.29%、106.35%；提取回收率分別為88.89%±5.43%、87.56%±5.54%、84.6%±3.21%。血漿樣品在室溫放置24 h、-4 ℃冷藏48 h、-20 ℃與-70 ℃冰箱冷凍保存后冷凍-解凍循環5次、-20 ℃與-70 ℃冰箱放置33 d、全血離心分離前基質中室溫和冰水浴2 h、血漿處理后提取物-4 ℃冷藏314 h后均穩定。

2.2 藥代動力學結果 藥代動力學結果如表2所示。空腹組有兩名受試者中途無理由退出，34名受試者數據納入藥動學參數計算。Cmax、AUC0～60、AUC0～∞與Vz的t值分別為9.61、5.64、5.15、4.15，P值均小于0.05，差異具有統計學意義，認為餐后條件下Cmax、AUC0～60、AUC0～∞顯著高于空腹條件下，而餐后組Vz顯著小于空腹條件下。Tmax與t1/2秩和檢驗的Z值分別為-0.52和-1.84，P值均大于0.05，差異無統計學意義，認為進食不會對藥物的t1/2與Tmax產生影響。Cl秩和檢驗的Z值為4.459 5，P值小于0.05，差異具有統計學意義，認為餐后組Cl顯著小于空腹組。血藥濃度時間曲線圖見圖1。

表2 空腹與餐后條件下口服5 mg非洛地平緩釋片后藥動學參數

注：采用雙側t檢驗，餐后組與空腹組相比，aP<0.05；采用秩和檢驗，餐后組與空腹組相比，bP>0.05

圖1 受試者在空腹或餐后條件下服用非洛地平緩釋片后血藥濃度-時間曲線圖

2.3 藥物累計吸收百分數 權重取1/c2，一室模型與二室模型的AIC分別為-44.24、-45.66，因此采用二室模型，選擇Loo-Riegelman法計算Fa。

(1)

t時周邊室藥物濃度：

(2)

k10為藥物消除速率常數；(Xp)t為t時周邊室的藥量，(Xp)t(n-1)為上一個時間點時周邊室的藥量；Vc為周邊室的分布容積，k12為藥物從中央室向周邊室轉運的一級速率常數；k21為藥物從周邊室向中央室轉運的一級速率常數；Δc為與上一時間點血藥濃度差值，Δt為與上一時間點時間差值。

其中k10、k12與k21來源于edgar等[9]的研究，k10=0.626，k12=0.727，k21=0.554。

空腹于餐后條件下非洛地平累計吸收曲線見圖2。

圖2 受試者在空腹或餐后條件下服用非洛地平緩釋片后24 h內非洛地平累計吸收百分數-時間曲線圖

在空腹與餐后條件下，藥物在24 h均未被完全吸收，餐后組藥物吸收速度與量遠大于空腹組。空腹組與餐后組在開始時藥物吸收均較快，空腹組在給藥5 h后吸收放緩，但直到24 h依然在持續吸收。餐后條件下在6 h前有較快的吸收，但6 h之后吸收累計吸收百分數基本穩定，很少再有吸收。進食對非洛地平緩釋片的吸收特征有顯著影響。

3 討論

本試驗采用LC-MS/MS法測定人血漿中非洛地平的濃度，相比于文獻[10-12]使用的高效液相色譜法、熒光光度法、紫外分光光度法等，具有更好的專屬性與靈敏度，定量下限達到了0.02 ng·mL-1，可以更精確的測定清除末期的血藥濃度，使藥動學參數計算更為準確。文獻[13-14]保留時間均大于5 min，時間較長；但是本方法血漿樣品處理較為繁雜，需要改進。

在選擇受試者時，由于非洛地平會具有導致牙齦出血的風險[15]，因而排除了牙齦炎的患者，試驗過程中有部分受試者出現了輕度的牙齦炎癥狀。相關文獻報道了非洛地平在空腹狀態下的藥動學參數，當采樣時間為72 h時t1/2大約在20 h左右[16-17]，與本試驗結果相近，也有文獻[18-19]報告t1/2在14 h左右，這可能與計算消除速率常數時的時間點不在消除末期，過遲或過早可能會導致計算結果偏大或偏小。將相關文獻[5-6,16-20]結果經劑量校正到與本試驗劑量相同后，空腹組Cmax均值在1.5 h·ng·mL-1左右、AUC0～t均值在19 h·ng·mL-1左右、AUC0～∞均值在21 h·ng·mL-1左右，本試驗結果與它們接近。有研究報道[17]非洛地平的血藥濃度-時間曲線下面積與CYP3A5*3 和 BCRPC421A 基因多態性有關，本試驗由于條件限制未能進行驗證；從藥代動力學結果還發現空腹組Cmax、AUC0～t與AUC0～∞的變異系數均在52%以上，而餐后組僅Cmax的變異系數在47%，AUC0～t與AUC0～∞的變異系數均小于33%。由空腹狀態與餐后狀態的Cmax、AUC0～t與AUC0～∞統計檢驗結果可知餐后組藥物吸收程度要顯著大于空腹組。柯曉丹[19]等人報道了空腹與餐后條件下AUC0～∞無顯著性差異，這個結果與本研究有所不同。以上結果表明餐后條件下人體對非洛地平緩釋片的吸收速度與程度均較大，可能是由于餐后條件下分泌的胃酸與膽汁使藥物得到更好的溶解。

由于人體節律，我們使用累計吸收百分數-時間曲線觀察了24 h內藥物的吸收狀況。結果較為直觀。從藥物的吸收過程來看，在24 h內藥物未被完全吸收。24 h后多數受試者的藥物可能已排出體外，且本試驗中未研究靜脈給藥的藥代動力學特征，相關參數參考了他人的研究。以上原因可能會導致計算結果與實際情況出現偏差，因此本試驗藥物吸收過程結果不能完全代表非洛地平緩釋片的吸收特征，可在比較空腹與餐后條件下人體對非洛地平吸收差異時作為參考。結果表明餐后狀態下服藥會使非洛地平的吸收速度與程度大幅度增加，與有關報道[21]相比結論一致，且本試驗人數遠大于該研究的8人，試驗結果更加可信。在服藥開始一段時間，空腹條件與餐后條件下藥物的吸收速度均較快，給藥6 h后，餐后組藥物吸收基本停止，而空腹組則在給藥5 h后呈現出持續而緩慢的吸收。

食物增加了非洛地平緩釋片的吸收速度與程度，空腹與餐后條件下非洛地平緩釋片在健康人體內的藥代動力學特征有較大的差異。