6 種農業(yè)特種養(yǎng)殖動物肉中18 種氨基酸含量分析

辛麗娜 劉常凱 何林飛 袁榕穗 陳圣杰 王捷

摘 要：針對目前國內新興的6 種農業(yè)特種養(yǎng)殖動物，即藍孔雀、眼鏡蛇、滑鼠蛇、海蛇、海龍和海星，探討6 種動物肉中18 種氨基酸含量的檢測方法。運用全自動氨基酸分析儀法測定上述6 種動物的18 種氨基酸含量，樣品經90%乙醇沉淀蛋白質后用6 mol/L鹽酸溶液水解22 h后離心，上清液氮吹干，用樣品稀釋液復溶，過濾膜上機檢測。以檸檬酸鈉和氫氧化鈉溶液為流動相進行梯度洗脫，熒光檢測器測定，除脯氨酸（Pro）檢測波長為440 nm外，其余17 種氨基酸檢測波長均為570 nm。結果表明：除胱氨酸質量濃度范圍為1.6～8.0 mg/L、牛磺酸為2.0～10.0 mg/L外，其余16 種氨基酸質量濃度范圍為3.2～16.0 mg/L時線性良好（r=0.998 5～0.999 9）;方法檢出限為0.04～0.42 mg/L;低質量濃度（16 種氨基酸質量濃度為6.4 mg/L，胱氨酸為3.2 mg/L，牛磺酸為4.0 mg/L）條件下的加標回收率為96.11%～109.76%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.14%～1.62%，高質量濃度（16 種氨基酸質量濃度為12.8 mg/L，胱氨酸為6.4 mg/L，牛磺酸為8.0 mg/L）條件下的加標回收率為96.12%～104.13%，RSD為0.11%～1.88%;精密度RSD為0.08%～0.94%，穩(wěn)定性RSD為0.16%～0.97%，重復性RSD為0.09%～0.91%。表明該方法快速易行、準確可靠，可用于藍孔雀、眼鏡蛇、滑鼠蛇、海蛇、海龍和海星的檢驗方法優(yōu)化。

關鍵詞：藍孔雀;眼鏡蛇;滑鼠蛇;海蛇;海龍;海星;牛磺酸;氨基酸

中圖分類號：TS207.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2019）02-0058-06

Abstract： In this paper， the contents of 18 amino acids in meat from 6 newly developed special farm animals， namely blue peacock， cobra， mouse snake， sea snake， sea dragon and sea star， were determined with an automatic amino acid analyzer. After protein precipitation with 90% ethanol， the samples were hydrolyzed with 6 mol/L hydrochloric acid solution for 22 hand then centrifuged. The supernatant was blown to dryness with nitrogen and the residue was re-dissolved and filtrated before being injected and analyzed. A mixture of sodium citrate and sodium hydroxide solutions was used as the mobile phase for gradient elution and fluorescence detection was performed at 440 nm for Pro and at 570 nm for 17 other amino acids. The results showed that the linear ranges were 1.6–8.0 mg/L for cystine， 2.0–10.0 mg/L for taurine， and 3.2–16.0 mg/Lfor other amino acids （r = 0.998 5–0.999 9）. The detection limits of the method were 0.04–0.42 mg/L. Recoveries from samples spiked at 3.2 mg/L for cystine， 4.0 mg/L for taurine， and 6.4 mg/L for other amino acids were in the range between 96.11% and 109.76% with relative standard deviations （RSDs） between 0.14% and 1.62%. Recoveries from samples spiked at 6.4 mg/L for cystine， 8.0 mg/L for taurine， and 12.8 mg/L for other amino acids were in the range between 96.12% and 104.13% with RSDs were 0.11% -1.88%. The precision， stability and repeatability RSDs were 0.08%–0.94%， 0.16%–0.97% and 0.09%–0.91%， respectively. This method was rapid， accurate and reliable， and could be used to determine amino acids in blue peacock， cobra， mouse snake， sea snake， sea dragon and sea star.

藍孔雀、眼鏡蛇、滑鼠蛇、海蛇、海龍和海星為我國近年來新興的農業(yè)特種養(yǎng)殖動物，國家政策鼓勵和支持特種養(yǎng)殖動物的研究開發(fā)利用及產業(yè)發(fā)展，減少對野生資源的依賴，具有保護野生動物和生態(tài)意義。同時，上述6 種動物是我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥藥材及特色食材。我國明朝李時珍《本草綱目》收載孔雀，曰其辟惡，解大毒、中毒、藥毒。服食孔雀后，服藥必不效，為其解毒也[1-3]。西漢《神農木草經》和唐代《本草拾遺》記載蛇，均曰其祛風燥濕、通絡活血，用于治療風濕痹痛、四肢麻術等。我國民間自古有南人嗜蛇的說法。滑鼠蛇蛇肉中所含的亮氨酸、賴氨酸、丙氨酸及纈氨酸為人體必需氨基酸，所含的谷氨酸使蛇肉清香味美，還能夠增強腦細胞活力，幫助記憶[4-5]。眼鏡蛇肉質細膩、滋味鮮美、祛風除濕、舒筋活絡，主治風濕性關節(jié)炎、無名疼痛等，是深受人們喜愛的可用于強身壯體的美味佳肴[6-7]。海蛇，味辛、咸、性平，歸肝、腎經，祛風止痛、通絡活血、滋補強壯等，用于治療風濕痹病、四肢麻木、關節(jié)疼痛及疥癬惡瘡等[8]。海龍可降低呼吸中樞興奮性，使呼吸運動趨于安靜而呈現(xiàn)鎮(zhèn)咳和平喘作用，海龍可強精益氣，主治四肢發(fā)冷、水腫的腎陽虛證[9-11]。海星可抗菌、降血壓、降血糖、抗疲勞、抗炎、促骨細胞生長、抗骨質疏松及調節(jié)生殖發(fā)育等[12]。牛磺酸可以調節(jié)機體糖類和脂類代謝、加強心臟功能、增強體質、消除疲勞和提高機體免疫力，尤其是可以改善學習記憶能力。隨著現(xiàn)代科技和醫(yī)學發(fā)展，人們日益認識到這6 種資源較高的營養(yǎng)、保健及醫(yī)藥價值，因其利于健康和防治疾病，市場需求不斷上升，推動了產業(yè)發(fā)展。

目前，檢測氨基酸的方法主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）[13-15]、HPLC-串聯(lián)質譜（HPLC-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）[16-18]和全自動氨基酸分析儀測定法[19-21]。全自動氨基酸分析儀的優(yōu)點[22]在于采用在線衍生和氮氣全封閉系統(tǒng)，可獲得較高靈敏度、較低檢出限和較好重現(xiàn)性。之前未見報道用全自動氨基酸分析儀測定藍孔雀、眼鏡蛇和滑鼠蛇肉中牛磺酸的含量，本研究運用全自動氨基酸分析儀法測定上述6 種動物肉中包括牛磺酸在內的18 種氨基酸的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人工養(yǎng)殖藍孔雀肉干粉 廣西龍鳳谷農業(yè)種植養(yǎng)殖場;人工養(yǎng)殖眼鏡蛇的活蛇樣品和滑鼠蛇的活蛇樣品及肉干粉樣品 廣西靈山龍璇蛇業(yè)有限公司;海蛇、海龍、海星 欽州市嘉園農商開發(fā)有限公司;將眼鏡蛇、滑鼠蛇活蛇樣品安樂死，洗凈并吸干表面水分，去皮及內臟，拆去蛇骨，剩余為實驗用的純蛇肉，以上樣品均為6 個批次。

氨基酸混合標準溶液（包括天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸和精氨酸，共17 種，除胱氨酸含量為1.25 μmol/mL外，其余16 種氨基酸含量均為2.50 μmol/mL） 德國Sigma-Aldrich公司;牛磺酸標準物質（純度99.0%） 上海安譜實驗科技股份有限公司。

鹽酸（優(yōu)級純）、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀（均為分析純）?國藥集團化學試劑有限公司;0.04 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH 3.45）、0.5 mol/L氫氧化鈉再生溶液、樣品稀釋液（0.12 mol/L鹽酸溶液，pH 2.20）、茚三酮（均為色譜純） 德國Sykam公司;高純氮氣（純度99.99%） 廣西瑞達化工技術有限公司;超純水（電阻率18.2 MΩ·cm） 實驗室自制。

1.2 儀器與設備

S433D全自動氨基酸分析儀 德國Sykam公司;XS205DU電子天平 瑞士Mettler Toledo公司;G560E快速混勻器 美國Scientific Industries有限公司;N-EVAP 112氮吹儀 美國Organomation Associates公司;Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司;韓國大韓WEB-6水浴鍋 蘇州安創(chuàng)儀器有限公司;S120H超聲波發(fā)生器 德國Elma公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：磺酸型陽離子交換樹脂;分離柱：不銹鋼柱（4.6 mm×60 mm，7 μm），填充交換樹脂，型號：No.855-3506（強酸型#2622SC-PH，日立）;柱溫57 ℃;流動相流速0.40 mL/min;反應柱：不銹鋼柱（4.6 mm×40 mm，7 μm），填充石英砂，型號：No.855-3523（日立）;反應器溫度135 ℃;茚三酮流速0.35 mL/min;進樣量50 μL;檢測波長：脯氨酸在440 nm波長處測定，其余16 種氨基酸和牛磺酸在570 nm波長處測定;流動相梯度洗脫程序如表1所示。

1.3.2 樣品前處理

眼鏡蛇鮮肉和滑鼠蛇鮮肉分別取2.0 g，加入90%乙醇沉淀蛋白后，加10 mL 6 mol/L HCl溶液均質粉碎均勻后轉移至水解管中，補足10 mL 6 mol/L HCl溶液;充入氮氣將水解管中的氧氣趕凈后立即密封，置烘箱中110 ℃水解22 h后取出;放置至室溫，測得其pH值約為4.9;轉移至離心管中，10 000 r/min離心5 min，取上清液5.0 mL水浴蒸干，用樣品稀釋液復溶至5.0 mL。

藍孔雀肉干粉、滑鼠蛇肉干粉、海蛇肉干粉、海龍肉干粉和海星肉干粉分別稱取2.0 g，加入90%乙醇沉淀蛋白后，加10 mL 6 mol/L HCl溶液，置于水解管中，充入氮氣將水解管中的氧氣趕凈后立即密封，置烘箱中110 ℃水解22 h后取出;放置至室溫，測得其pH值約為6.6;用6 mol/L HCl溶液調節(jié)pH值至5.0±0.2后轉移至離心管中，10 000 r/min離心5 min，取上清液5.0 mL水浴蒸干，用樣品稀釋液復溶至5.0 mL。

1.3.3 標準溶液的配制

精密稱取牛磺酸標準品100.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用超純水定容，搖勻，配制成質量濃度為10 mg/mL的標準儲備溶液。取牛磺酸標準儲備溶液1 mL置于50 mL容量瓶中，用樣品稀釋液定容，搖勻，配制成質量濃度為200 μg/mL的標準工作溶液，置于4 ℃冰箱中1 個月，備用。

分別精密量取牛磺酸標準工作溶液和氨基酸混合標準溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別加入到10 mL容量瓶中，用樣品稀釋液稀釋成不同質量濃度的系列混合標準溶液。

1.3.4 氨基酸含量測定

對藍孔雀等6 種動物肉各6 個批次進行游離氨基酸含量測定及分析，按照公式（1）～（2）計算。

1.3.5 回收率實驗

取藍孔雀肉干粉樣品，將其作為空白基質，加入低質量濃度混合標準溶液（16 種氨基酸質量濃度為6.4 mg/L，胱氨酸質量濃度為3.2 mg/L，牛磺酸質量濃度為4.0 mg/L）和高質量濃度混合標準工作溶液（16 種氨基酸質量濃度為12.8 mg/L，胱氨酸質量濃度為6.4 mg/L，牛磺酸質量濃度為8.0 mg/L），按照1.3.2節(jié)的方法處理樣品，分別進行3 次平行實驗，測定相應的峰面積，計算平均回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.6 精密度實驗

精密吸取同一批藍孔雀樣品溶液，按照1.3.1節(jié)中的色譜條件，進樣50 μL，平行測定5 次。分別測定18 種氨基酸的含量，計算RSD，考察方法的精密度。

1.3.7 穩(wěn)定性實驗

精密吸取同一批藍孔雀樣品溶液，在0、2、4、6、8 h各進樣50 μL，分別測定18 種氨基酸的含量，計算RSD，考察方法的穩(wěn)定性。

1.3.8 重復性實驗

均勻稱取藍孔雀樣品6 份，每份1.00 g，按照1.3.2節(jié)的方法處理樣品，分別測定18 種氨基酸的含量，計算RSD，考察方法的重復性。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

眼鏡蛇鮮肉和滑鼠蛇鮮肉均為鮮肉樣品，計算結果按干基折算。經過反復實驗，鮮肉樣品的pH值為6.1，肉干粉樣品性狀已經為干基，肉干粉的pH值為6.8，根據氨基酸分析儀特性和氨基酸結構特點，最后上機樣品需為酸性，pH值3.5～4.5，此時對氨基酸的分離效果比較好。

2 種基質基線無差別，均較毛躁

由表2可知，鮮肉和肉干粉水解后的狀態(tài)不同，酸堿性不同，氨基酸水解出來的程度也會不同，因此樣品經過水解后的水解液需要測定pH值。同時，無論鮮肉還是肉干粉，樣品本身均含蛋白質、脂肪等大分子物質，若上機前不進行去除，雜質會干擾目標峰，影響積分，造成定量不準確。因此，本研究采用2 種不同的樣品前處理方法進行考察。

方法1：目前，去除蛋白質的常用溶劑為乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液[23-25]，本研究考察這2 種沉淀劑對鮮肉樣品和肉干粉樣品中蛋白質的沉淀效果[26-28]。稱取樣品1.0 g，分別加入上述2 種沉淀劑。由表2可知，乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液能夠很好地去除蛋白質。去除蛋白質等雜質后的樣品加入10 mL 6 mol/L HCl溶液進行水解[29-31]。

方法2：常規(guī)氨基酸分析儀用90%乙醇溶液對鮮肉樣品和肉干粉樣品中的蛋白質等大分子物質進行沉淀去除，結果如表2所示。去除蛋白質后的樣品經過氮吹干，加入10 mL 6 mol/L HCl溶液，置于水解管中進行水解。

方法1中的乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液雖然蛋白質沉淀效果較好，但是經過上機發(fā)現(xiàn)，各氨基酸的基線不穩(wěn)，比較毛躁，且目標峰響應值不高，仍有部分雜質峰干擾，原因可能是乙酸鋅和亞鐵氰化鉀影響色譜柱對目標峰的分離。本研究所用色譜柱為陽離子交換柱，上述2 種沉淀劑均含有陽離子，會使得色譜柱柱效降低，進而導致游離氨基酸總量檢測不準確。方法2中大部分蛋白質在90%乙醇中變性，再經過酸水解后也能去除一部分蛋白質，使氨基酸肽鏈斷開，各氨基酸基線平穩(wěn)，目標峰響應值較高，峰形較好，雜質干擾少。綜上所述，本研究采用方法2進行樣品前處理。

2.2 方法的線性關系及檢出限

2.3 方法回收率、精密度、穩(wěn)定性及重復性

由表4可知：低質量濃度條件下的加標回收率為96.11%～109.76%，RSD為0.14%～1.62%，高質量濃度條件下的加標回收率為96.12%～104.13%，RSD為0.11%～1.88%;精密度RSD為0.08%～0.94%;穩(wěn)定性RSD為0.16%～0.97%;重復性RSD為0.09～0.91%。表明此方法的準確性高，精密度、穩(wěn)定性及重復性均較好。

2.4 樣品測定結果

鮮肉所含水分對檢測結果會有影響，所以鮮肉的氨基酸和牛磺酸含量最終結果均按干燥品計算。通過實驗，測得眼鏡蛇鮮肉和滑鼠蛇鮮肉的水分含量分別為67.85%和69.51%，可見鮮肉中所含水分較大會導致樣品結果差異也較大，因此在進行結果計算時，應扣除水分后得到準確結果。

由表5可知，藍孔雀和滑鼠蛇鮮肉以及海蛇肉干粉的氨基酸總量和牛磺酸含量均較高，雖然不同樣品的氨基酸總量和牛磺酸含量有所不同，但結果均高于方法檢出限，因此，這些樣品原料所含成分具有一定的藥用價值，對今后保健品行業(yè)也有一定的參考作用。

3 結 論

本方法建立在全自動氨基酸分析儀基礎上，對6 種農業(yè)特種養(yǎng)殖動物肉的藥用價值進行探究，檢測出18 種氨基酸，能夠為保健品行業(yè)提供很好的數據資料。同時，本方法操作簡單、便捷、實用性強，實現(xiàn)了全自動氨基酸分析儀對藍孔雀、眼鏡蛇、滑鼠蛇、海蛇、海龍及海星肉中18 種氨基酸含量的快速測定，為今后檢測藍孔雀肉、海蛇肉等動物的包括牛磺酸在內的18 種氨基酸含量提供了參考依據。

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