乳癖消對曲妥珠單抗致大鼠心肌毒性的抑制作用研究*

董 林，曲芳菲，李永梅，于守君

（濱州醫學院煙臺附屬醫院，山東 煙臺 264100）

乳腺癌的生長、侵犯、轉移與人類表皮生長因子受體-2（Her2）的表達密切相關。Her2過度表達的乳腺癌患者病情進展迅速，化學治療及內分泌治療的效果較差，預后不佳，總生存率偏低[1-2]。曲妥珠單抗（商品名赫賽?。┦且环N重組人源化單克隆抗體，可特異性地與Her2結合，抑制其促進細胞增殖的活性，發揮靶向抗腫瘤作用，臨床主要用于治療組織學檢測Her2高表達的乳腺癌[3]。盡管曲妥珠單抗療效顯著，但患者常出現心功能不全的癥狀，主要表現為左心室收縮功能下降、左心室射血分數（LVEF）降低[4]，血清中肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳 酸 脫 氫 酶（LDH）、心 肌 肌 鈣 蛋 白I（cTnI）及N末端腦利鈉肽（NT-pro BNP）等心肌缺血或損傷的標志物濃度顯著上升[5]，必須停止用藥。Her-2受體抑制劑可造成大鼠心肌細胞線粒體功能受損，導致細胞凋亡[6]。可能與曲妥珠單抗引起的心肌毒性與線粒體凋亡通路有關。傳統中醫理論認為，乳癖消具有軟堅散結、活血消瘀、疏肝解郁功效，能降低血清中雌二醇與孕酮水平[7]，臨床主要用于治療乳腺增生、乳腺炎癥，現也作為乳腺癌抑制雌激素的輔助用藥。乳癖消中芍藥苷、三七皂苷、人參皂苷、連翹苷、哈巴俄苷、木犀草素、槲皮素等成分均能促進血液循環、改善心肌能量代謝、清除自由基[8]。曲妥珠單抗聯用乳癖消治療乳腺癌，既可增強療效，又可降低心臟毒副作用。Her-2與大鼠相對應的基因具有高度同源性[9]。本研究中擬通過大鼠尾靜脈注射曲妥珠單抗建立心肌損傷模型，探討乳癖消對該藥所致心肌毒性的抑制作用[10]，為優化乳腺癌的治療方案提供參考。

1 材料與方法

1．1 材料

實驗動物：SPF級6周齡Wistar雌性大鼠50只，體質量（199±8．5）g，購于山東大學實驗動物中心，動物合格證號為SCXK（魯）20090001。

儀器：ACUSON SC2000型超聲顯像儀（Siemens公司）；ELx-808型全自動酶標儀（Bio-Tek公司）；AU5800型全自動生化分析儀（Beckman公司）；Elecsys2010型全自動免疫分析儀（Roche公司）；Model 705型超聲勻漿器、Sorvall ST40型臺式離心機（Thermo Scientific公司）。

試藥：注射用曲妥珠單抗（商品名赫賽汀，上海羅氏制藥有限公司，國藥準字J20170037，規格為每瓶440 mg／20 mL）；乳癖消顆粒（哈爾濱泰華藥業股份有限公司，國藥準字Z19990028，規格為每袋8g）；CK-MB，LDH，cTnI，NT-pro BNP，MDA，SOD檢測試劑盒均購于碧云天生物技術研究所；Bcl-2，Bax含量測定試劑盒、半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶（Caspase）-9、Caspase-3活性測定試劑盒均購于美國Biovision公司；硫化鈉（Na2S）、水合氯醛溶液（上海阿拉丁生化技術有限公司）。

1．2 方法

動物分組與給藥：將50只雌性Wistar大鼠隨機分為模型組、實驗組（高、中、低劑量組）和對照組，各10只。模型組大鼠經尾靜脈注射曲妥珠單抗8 mg／kg；實驗組注射曲妥珠單抗后按0．6，0．8，1．0 g／kg灌服乳癖消顆粒溶液；對照組注射相應體積的曲妥珠單抗專用溶劑。連續給藥7 d后進行各項實驗檢測。

溶液配制：注射用曲妥珠單抗用專屬溶劑溶解，配成質量濃度為22 g／L的溶液，4℃保存備用，實驗時提前恢復至室溫。按各實驗組大鼠服用劑量稱取乳癖消顆粒，加入適量溫水沖配成溶液，每日1次給予灌胃。

1．3 觀察指標

心功能：各組大鼠經腹腔內注射每100 g體質量0．3 mL水合氯醛，麻醉，仰臥固定于操作臺上，用Na2S溶液脫去胸前雜毛，超聲顯像儀取胸骨旁左室長軸切面檢測各項心功能指標[左心室后壁舒張期厚度（LVPWd）、左心室后壁收縮期厚度（LVPWs）、左心室舒張末期內徑（LVEDd）、左心室收縮末期內徑（LVESd）]，計 算 左 心 室 射 血 分 數（LVEF，%）≈（LVEDd3-LVESd3）／LVEDd3×100%，短軸縮短率（LVFS，%）=（LVEDd-LVESd）／LVEDd×100%。

心肌損傷血清標志物：固定好已麻醉的大鼠，清潔尾部污垢，用手術剪剪去尾尖2～3 mm，用手從尾根向下輕輕擠壓，將血液收集于離心管中至1．0 mL，靜置30 min后3 000 r／min離心，吸取500μL血清測定各項生化指標。用全自動生化分析儀檢測血清CK-MB和LDH的濃度，用干式免疫熒光法試劑盒檢測cTnI和NT-pro BNP的水平。

線粒體凋亡途徑蛋白：將已麻醉的大鼠仰臥固定于解剖板上，去除胸前雜毛，沿劍突開始剪開胸骨，充分暴露胸腔，剪斷各條連通心臟的血管，迅速取出心臟，在4℃預冷冰袋的培養皿內將心臟組織剪碎，稱取約100 mg，在冰浴條件下以超聲勻漿器制成勻漿。在4℃條件下，3000r／min離心10min，吸取上清液，以微孔濾膜濾過，用BCA法蛋白定量試劑盒測定各個樣品的總蛋白含量，作為參考調整后續實驗的上樣量。按照Bcl-2，Bax，Caspase-9，Caspase-3檢測試劑盒說明書測定吸光度值，以標準曲線回歸法計算各種蛋白的含量或活性。

心肌氧化應激水平：取上述心肌組織上清液，按MDA和SOD檢測試劑盒的說明書操作，按公式將吸光度值換算成MDA和SOD的含量。

1．4 統計學處理

2 結果

2．1 心功能超聲檢測結果

與對照組相比，模型組大鼠的LVED和LVPW均有顯著變化（P＜0．05），LVEF和LVFS顯著降低（P＜0．05），表明其心功能已明顯受損。與模型組比較，低劑量組除左心室容積有所改善外，其余指標未見好轉，而中、高劑量組可顯著抑制心肌組織的損傷變?。≒＜0．05），增加左心室舒張末期容積和減少收縮末期容積（P＜0．01），最終提高LVEF和LVFS（P＜0．05），大鼠的心功能狀況得到改善。詳見表1。

表1 各組大鼠心功能指標比較（X±s，n=10）

2．2 心肌損傷血清標志物檢測結果

與對照組相比，模型組大鼠血清中CK-MB，LDH，cTnI，NT-proBNP等標志物的濃度均顯著升高（P＜0．01），表明其心肌組織已出現較嚴重的損傷和壞死。與模型組比較，各實驗組隨著乳癖消劑量的增加，以上血清標志物濃度逐漸降低（P＜0．05），其中高劑量組的下降幅度更顯著（P＜0．01），表明各實驗組大鼠的心肌組織損傷狀況明顯得到緩解。詳見表2。

表2 各組大鼠血清中CK-MB，LDH，cTnI，NT-pro BNP水平比較（X±s，n=10）

2．3 線粒體凋亡途徑相關蛋白測定結果

與對照組相比，模型組大鼠心肌組織中Bcl-2的表達顯著下調，Bax的表達顯著加強（P＜0．01），Bcl-2與Bax的含量比值顯著減少（P＜0．05），致使Caspase-9和Caspase-3的活性增強（P＜0．01），從而促進細胞凋亡。與模型組比較，各實驗組隨著乳癖消劑量的增加，Bax的表達與Caspase-9，Caspase-3的活性逐漸降低，Bcl-2的表達量和Bcl-2／Bax的比值逐漸增加（P＜0．05），表明乳癖消可通過逆轉Bcl-2和Bax的相對表達量而阻止Caspase-9及Caspase-3的激活，從而抑制心肌細胞的凋亡。詳見表3。

表3 各組大鼠心肌組織中Bcl-2和Bax的表達量與Caspase-9和Caspase-3的活性比較（X±s，n=10）

2．4 MDA含量和SOD活性檢測結果

與對照組相比，模型組大鼠心肌組織中的MDA含量顯著升高，而SOD的活性顯著下降（P＜0．01），表明該組大鼠的心肌組織已出現氧化應激損傷，細胞脂質結構受到氧化破壞。與模型組比較，各實驗組隨著乳癖消劑量的增加，MDA含量逐漸降低（P＜0．05），SOD的活性顯著增加（P＜0．05），其中高劑量組的作用最明顯（P＜0．01），表明乳癖消可抑制氧化應激反應對細胞造成的損傷。詳見表4。

表4 各組大鼠心肌組織中MDA的含量和SOD的活性比較（X±s，n=10）

3 討論

Her2屬跨膜受體型酪氨酸激酶，是Her2／neu原癌基因的表達產物，在腫瘤增殖、侵襲、轉移過程中扮演重要角色。因此，Her2一直作為乳腺癌靶向藥物的研究重點，目前上市的靶向藥物有曲妥珠單抗、帕妥珠單抗等單抗藥物[11]，小分子靶向藥物拉帕替尼和阿法替尼，抗腫瘤效果理想，但隨著用藥時間和累積劑量的不斷增加，該類藥物引發心臟毒副反應的概率也逐漸上升，目前阿法替尼已因心肌毒性過高而在臨床上逐漸被減少使用[12]。Her2蛋白不僅表達于腫瘤細胞，也表達于心肌組織和血管內皮上，Her2相關信號通路具有穩定心肌纖維結構、降低氧化應激損傷、促進血管內皮修復的作用。Her2靶向藥物發揮抗腫瘤作用，同時也抑制Her2通路對細胞的保護作用，引起心臟血管損傷，妨礙血液供應，導致心肌缺氧，引起氧化應激，最終導致細胞凋亡[13]。

本研究結果顯示，心臟超聲顯像檢測和血清學指標表明，乳癖消可促進大鼠心肌血管修復，改善血液循環，抑制心肌缺血壞死，進而保護心肌纖維結構，降低曲妥珠單抗所致心功能的衰退。凋亡相關蛋白的檢測表明，乳癖消可通抑制線粒體凋亡途徑保護心肌細胞。在線粒體凋亡途徑中首要發揮調控作用的蛋白是Bcl-2和Bax，兩者在線粒體外膜上含量的比例是決定細胞凋亡的重要因素[14]。Caspase是一類與凋亡密切相關的蛋白水解酶家族，具有聯級傳遞和執行凋亡反應的作用，其中Caspase-9是內源性凋亡途徑（又稱線粒體途徑）的專屬調控蛋白，受Bcl-2和Bax含量的比例調控；Caspase-3是執行細胞凋亡的效應蛋白，其活性受Caspase-9的調控，經Caspase-9激活后的Caspase-3可促進核內DNA斷裂降解，最終使細胞凋亡[15]。本研究結果顯示，乳癖消可通過上調Bcl-2和下調Bax的表達，提高Bcl-2／Bax的比例，從而抑制Caspase-9的活性，進而阻止Caspase-3執行細胞凋亡程序[16]。SOD的活性和MDA的含量是評價氧化應激的損傷指標。當心肌發生缺血損傷后，由于仍有血液經側支血管供氧，導致胞內氧自由基堆積，引起細胞脂質結構的氧化破壞，導致原處于缺氧狀態的細胞進一步受損[17]。SOD和MDA的檢測結果表明，乳癖消能降低活性氧的含量，抑制細胞膜脂質氧化，進一步發揮保護細胞的作用。

乳癖消由鹿角、蒲公英、昆布、天花粉、雞血藤、三七、赤芍、海藻、漏蘆、木香、玄參、丹皮、夏枯草、連翹、紅花15味中藥材組方，其中鹿角、三七、玄參、紅花、赤芍、木香等藥材具有改善心肌供氧，治療心力衰竭，降低再灌注損傷的作用。乳癖消中含有芍藥苷、三七皂苷、人參皂苷、連翹苷、哈巴俄苷、木犀草素、槲皮素等苷類化合物，均有促進血管修復生長、改善線粒體能量代謝、促進自由基清除等藥理活性，從而發揮心肌保護作用[18]。本研究結果表明，乳癖消可有效降低曲妥珠單抗抑制Her2為受體通路所致心肌毒性，由此可推測其亦可降低其他Her2靶向藥物的心臟毒副作用。因此，在Her2陽性的乳腺癌治療過程中，當需要使用帕妥珠單抗、拉帕替尼或阿法替尼時，可考慮聯用乳癖消制劑作為降低心肌毒性的輔助用藥。