正交設計優化磷酸川芎嗪-冰片脂質體的制備工藝*

劉劍敏，唐靜宜，程 路，陳 凡

（湖北省武漢市第一醫院藥學部，湖北 武漢 430022）

天然活性成分川芎嗪（TMP）為常用腦血管疾病治療藥物[1-2]。目前，臨床常用川芎嗪普通制劑有片劑、膠囊劑和注射劑[3-4]。其口服制劑半衰期短（0．5～2 h）、生物利用度低（10%～30%）[5]，靜脈注射4～6 h可達血藥濃度要求，但給藥用藥不方便。與靜脈給藥相比，經鼻給藥能迅速將藥物經嗅球直接轉運至大腦和脊髓，達到相同的生物利用度[6]。ILLUM[7]報道，鼻噴霧劑給藥能有效提高TMP在腦內的轉運，這種非侵入性的高效方式對腦缺血損傷的療效顯著。脂質體作為經鼻給藥的載體具有天然優勢，首先具有較強的生物黏附性，藥物可緩慢釋放，具有腦部靶向性[8-9]，另外還具有生物利用度高、刺激性小、不良反應少等優點[10]。冰片常作為川芎的藥對組合用于治療心腦血管疾病，配伍冰片對腦缺血損傷的保護明顯優于單用[11-12]，具有明顯的腦靶向優勢，也為缺血性腦損傷防治提供了可能。本研究中探討了磷酸川芎嗪（TMPP）與冰片（B）配伍脂質體的制備方法，為該劑型藥物抗腦缺血損傷的應用提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀（島津貿易＜上海＞有限公司）；RE-5299型旋轉蒸發儀（上海振榮科學儀器有限公司）；XSP-1C型粒徑測定儀（上海精密儀器廠）；W201D型數控恒溫水浴鍋（上海申順科技有限公司）；葡聚糖凝膠-G50（北京化學試劑公司）。

1．2 試藥

磷酸川芎嗪對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為100845-201702，純度為99．2%）；冰片（四川青神康華制藥有限公司，批號為170314）；Triton-X100（進口分裝，中國碧云天公司，批號為ST795）；磷酸川芎嗪原料（北京燕京制藥廠，批號為20170123，純度＞99%）；大豆磷脂（山海太偉藥業有限公司，批號為20170307），膽固醇（北京化學試劑公司，批號為20170402）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2．1 TMPP-B脂質體的制備

取一定比例的大豆磷脂和膽固醇，置圓底燒瓶，精密稱定，加入十八胺，以乙醇溶解，水浴減壓蒸發除去溶劑，得分布均勻的薄膜，加入一定濃度的硫酸銨溶液水化，超聲得空白脂質體混懸液[13]。將空白脂質體經葡聚糖凝膠G-50微型柱（10 cm×1 cm）以pH=7．4磷酸鹽緩沖液（PBS）進行洗脫，收集洗脫后的空白脂質體，加入固定比例的TMPP-B藥液，于水浴中孵化，即得TMPP-B脂質體。

2．2 包封率測定

2．2．1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zobox C18柱（150 mm×4．6 mm，5μm）；流動相：甲醇-水（50∶50，V／V）；檢測波長：295 nm；流速：1 mL／min；柱溫：25℃；進樣量：20μL。磷酸川芎嗪保留時間為7．5 min，色譜圖見圖1，空白脂質體在此保留時間未出峰。

2．2．2 溶液制備

對照品溶液：稱取TMPP適量，精密稱定，加入甲醇-水（50∶50）溶解，制備成質量濃度為100 mg／L的貯備液，備用。

供試品溶液：取TMPP-B脂質體適量，置離心管中，以15 000 r／min的轉速離心30 min。分別取離心后的上清液和未離心脂質體溶液各適量，后者加Triton-X100溶解，即得。

2．2．3 方法學考察

圖1 高效液相色譜圖

標準曲線制備：用50%甲醇將對照品貯備液稀釋成5．0，10．0，25．0，50．0，100．0 mg／L的系列標準溶液，按擬訂色譜條件分別進樣20μL。以峰面積（A）對質量濃度（C，mg／L）進行線性回歸，得回歸方程A=0．562 1C-0．481 8，r=0．999 3（n=5）。結 果 表 明，TMPP質量濃度在5．0～100．0 mg／L范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取質量濃度為20．0 mg／L TMPP對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣6次，計算TMPP含量。結果的RSD為0．34%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：配制TMPP對照品溶液6份，分別按擬訂色譜條件進行檢測，計算6份溶液中TMPP峰面積與稱樣質量的比值。結果的RSD為0．58%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：分別精密吸取TMPP-B脂質體0．5mL，以Triton-X100溶解并定容至50 mL，得供試品溶液。分別于0，1，2，3，5，8 h時依法進樣測定。結果的RSD為1．26%（n=6），表明供試品溶液在8 h內穩定。

加樣回收試驗：取20．0 mg／L對照品溶液1，2，3 mL，加入空白脂質體，以Triton-X100溶解并定容至20 mL，按擬訂色譜條件進樣測定。結果TMPP的平均回收率為101．38%，RSD為1．09%（n=3）。

2．2．4 樣品含量測定

取2．2．2項下供試品溶液和對照品溶液適量，按2．2．1項下條件測定TMPP含量，得到WT和WF，計算包封率（E，%）=（WT-WF）／WT×100%。

2．3 制備工藝優化

根據前期單因素考察預試驗結果，以磷脂-膽固醇質量比（因素A）、TMPP-（磷脂＋膽固醇）質量比（因素B）、水化時間（因素C）及（NH4）2SO4濃度（因素D）為考察因素，進行正交設計。采用乙醇注入式（NH4）2SO4梯度法制備TMPP-B脂質體，以包封率為考察指標，分別對試驗結果進行直觀分析和方差分析。結果見表1和表2。

由表1可知，這4項因素對TMPP-B包封率的影響程度為A＞D＞B＞C，且最佳工藝條件為A1B2C1D2，即磷脂-膽固醇（2∶1），（磷脂＋膽固醇）-TMPP（15∶1），水化時間為30 min，（NH4）2SO4質量濃度為0．2μmol／L。由表2可知，因素A，B，D影響顯著。以最優工藝制備3批TMPP-B脂質體，計算得包封率為（73．14±0．71）%，該工藝穩定可行。

表1 TMPP-B脂質體制備L9（34）正交設計及直觀分析

表2 方差分析結果

2．4 其他評價指標

TMPP-B脂質體粒徑，以XSP-1C型粒徑測定儀進行粒徑分布測定，粒徑分布在113～145 nm范圍內，平均粒徑為（136．10±6．30）nm，分布均勻；Zeta電位為（-35．70±3．60）mV。取最優工藝制備3批TMPP-B脂質體，置4℃冰箱，放置4周，未見分層、變色、沉淀和破乳等改變，表明該工藝質量穩定。

3 討論

3．1 脂質體制備方法

常規的制備方法有被動載藥法中的薄膜分散、注入法等，主動載藥法中的pH梯度法、（NH4）2SO4梯度法等[9]。新型制備方法較多，如超臨界反相蒸發法、冷凍干燥法、溫度敏感脂質體、配體靶向修飾脂質體等[9]。常規制備方法雖存在脂質體包封率較低、粒徑不均一、有機溶劑殘留等缺點，但由于對所需設備要求低、生產周期較短、具體方法簡單易行、所得產品性質穩定性良好等眾多優勢而應用廣泛。

TMPP水溶性良好，故選用改進的乙醇注入式（NH4）2SO4梯度法，制備條件溫和，避免了高溫對磷脂的氧化，且有機溶劑殘留少，所得TMPP-B脂質體包封率達（73．14±0．71）%，且載藥量適宜，穩定性良好。在包封率測定方法的選擇上，預試驗中對比分析了凝膠過濾法和離心法2種測定方法，結果發現以15 000 r／min離心30 min分離游離TMPP和脂質體，所得結果與凝膠過濾法無明顯差異，故本研究中選擇操作更方便快速的離心法進行。

3．2 物料比例

TMPP-B脂質體制備時，預試驗考察了影響最終產品質量的諸多因素，發現磷脂-膽固醇質量比、TMPP-（磷脂＋膽固醇）質量比、（NH4）2SO4濃度及水化時間為主要影響因素。磷脂與膽固醇合適比例對穩定脂質體結構和提高包封率起至關重要的作用，磷脂濃度增加，藥物包封率隨之提高。但磷脂用量過大會造成水化不完全，且易凝聚，不利于產品穩定性。膽固醇比例過大會使脂質體易破裂，造成藥物的滲漏；而過少又會增加脂質體的膜流動性。磷脂與膽固醇的比例控制在2～7比較好[14]。

3．3 研究價值

正交設計、直觀分析和方差分析結果顯示，以包封率為考察指標，考察四因素不同水平對TMPP包封率的影響，結果表明，該制備工藝的脂質體包封率高，分布均勻，形態好，質量穩定，該方法簡單、合理。

冰片可促進川芎嗪在腦部的分布[11-12]，兩者聯用治療腦血管疾病更快速。隨著新劑型的開發，藥物生物利用度的提高，穿透血腦屏障實現腦靶向成為可能，為后期的腦缺血損失治療研究提供參考。