茵丹顆粒微生物限度檢查方法學驗證

鄧 莉，周 劍，胡 婧，胡 斌，馬 攀

（陸軍軍醫大學第一附屬醫院藥劑科，重慶 400038）

茵丹顆粒為我院自制制劑，具有清熱利濕、涼血活血等功效，主治痤瘡、脂溢性皮炎，療效確切，其中連翹、黃芩、地榆、茵陳等中藥材具有抗病原微生物作用[1-6]。中成藥的不同成分和濃度對微生物有著不同程度的抑制和殺滅作用[7-10]。由于抑菌成分的干擾，采用常規法進行微生物限度檢查，其結果不能真實反映其污染微生物的狀況[11]，因此采用適當的方法排除其抑菌成分的干擾，提高中成藥污染微生物的檢出率至關重要[12]。為保證微生物限度檢查法結果的準確性，本研究中依據2015年版《中國藥典（四部）》1105非無菌產品微生物限度檢查[13]中微生物計數法、1106非無菌產品微生物限度檢查，控制菌檢查法中方法驗證試驗，以及和通則1107非無菌藥品微生物限度標準的要求，建立了茵丹顆粒微生物限度檢查方法，并進行驗證，確保檢測方法的可行性。

1 儀器與材料

1．1 儀器

Thermo Scientific-1381 A2型生物安全柜（美國Thermo公司）；BL150型電子天平（梅特勒托利多儀器＜上海＞有限公司）；LRH-150F型生化培養箱（重慶四達實驗儀器公司）；MJ-180-Ⅱ型霉菌培養箱（上海躍進醫療器械有限公司）；LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）。

1．2 材料

試藥：茵丹顆粒（陸軍軍醫大學第一附屬醫院藥劑科，批號為18032701，規格為每袋10 g）。

培養基：胰酪大豆胨液體培養基（批號為161205），胰酪大豆胨瓊脂培養基（批號為1612192），沙氏葡萄糖液體培養基（批號為170815），沙氏葡萄糖瓊脂培養基（批號為1702134），麥康凱液體培養基（批號為161205），麥康凱瓊脂培養基（批號為161212），均由北京三藥科技開發公司提供。

稀釋劑、沖洗劑：pH 7．0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（北京三藥科技開發公司，批號為170519）；0．9%氯化鈉溶液（西南藥業股份有限公司，批號為17034002）。

菌種：金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]，枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]，銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]，白 色 念 珠 菌[CMCC（F）98001]，黑 曲 霉 菌[CMCC（F）98003]，大腸埃希菌[CMCC（B）44102]，均由中國食品藥品檢定研究院提供，試驗所用菌株均為第3代。

2 方法與結果

2．1 菌液制備

取經胰酪大豆胨液體培養基35℃培養24 h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌液體培養物，分別用0．9%氯化鈉溶液稀釋成適宜濃度的菌懸液，作活菌計數備用。

取經沙氏葡萄糖液體培養基25℃培養48 h的白色念珠菌液體培養物，用0．9%氯化鈉溶液稀釋成適宜濃度的菌懸液，作活菌計數備用。

取經沙氏葡萄糖瓊脂培養基25℃培養7 d的黑曲霉菌斜面培養物，加入含0．05%（V／V）聚山梨酯80的0．9%氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸出孢子懸液（用管口帶有薄無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌毛細吸管）置無菌試管內，用0．9%氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。

2．2 微生物限度檢查方法驗證

2．2．1 供試液制備

取樣品10 g，加pH 7．0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，搖勻，制成1∶10的供試液。取供試液10 mL，加pH 7．0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，搖勻，制成1∶100供試液。

2．2．2 計數方法適用性試驗

試驗組[14]：分別精密吸取2．3．1項下1∶10供試液和1∶100供試液9．9 mL，各5份，每份中分別加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌及黑曲霉菌菌懸液各0．1 mL，使每1 mL含菌數不大于100 cfu，混勻，吸取各染菌供試液1 mL注入平皿中，每份平行制備2個平皿，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基，置35℃培養3 d，測定需氧菌總數。取2．3．1項下1∶10供試液9．9 mL，共2份，每份中分別加入白色念珠菌和黑曲霉菌菌懸液各0．1 mL，使每1 mL含菌數不大于100 cfu，混勻，吸取各染菌供試液1 mL注入平皿中，每份平行制備2個平皿，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基，置25℃培養5 d，測定霉菌及酵母菌總數。

菌液對照組：吸取pH 7．0氯化鈉-蛋白胨緩沖液9．9 mL，共5份，每份中分別加入金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌懸液各0．1 mL，使每1 mL含菌數不大于100 cfu，混勻，分別從試驗菌試管中吸取1 mL注入平皿中，每株試驗菌平行制備2個平皿，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基；另取pH 7．0氯化鈉-蛋白胨緩沖液9．9 mL，共2份，每份中分別加入白色念珠菌、黑曲霉菌菌懸液各0．1 mL，使每1 mL含菌數不大于100 cfu，混勻，分別從試驗菌試管中吸取1 mL注入平皿中，每株試驗菌平行制備2個平皿，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基。

供試品對照組：分別精密吸取1∶10和1∶100供試液各1 mL注入平皿，分別平行制備4個平皿，其中4個平皿傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基，作為需氧菌總數的供試品對照組；另外4個平皿傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基，作為霉菌和酵母菌總數的供試品對照組。

稀釋劑組：取相應量稀釋液替代供試品，同試驗組方法操作，按試驗組方法測定其菌數，平行制備2個平皿。

驗證結果：依照下列公式，計算加菌回收率，試驗組菌比值=（試驗組平均菌落數-供試品對照組的平均菌落數）／菌液對照組的平均菌落數。按2015年版《中國藥典（四部）》1105，1106，1107項下[2]規定進行結果判斷，回收率比值應在0．5～2．0。結果見表1至表2。可見，需氧菌總數采用稀釋法（1∶100）、霉菌和酵母菌總數采用常規法，各株菌回收率均為0．5～2．0，符合2015年版《中國藥典（四部）》微生物限度檢查微生物計數檢查驗證要求。

2．2．3 控制菌-大腸埃希菌檢查

試驗組：取10 mL 2．3．1項下1∶10供試液及每1 mL含菌量不大于100 cfu大腸埃希菌菌懸液，同時加入100 mL胰酪大豆胨液體培養基中，混勻，35℃培養24 h。取上述培養物1 mL接種至100 mL麥康凱液體培養基中，42℃培養24 h。取麥康凱液體培養物劃線接種至麥康凱瓊脂培養基平板上，35℃培養24 h，觀察。

表1 1∶10及1∶100供試液需氧菌總數回收率比值試驗結果（n=3）

表2 1∶10供試液霉菌和酵母菌回收率比值試驗結果（n=3）

菌液對照組：不加供試液，其余操作同試驗組。

供試品對照組：取2．3．1項下1∶10供試液10 mL，以稀釋液代替菌液其余操作同試驗組。

稀釋劑組：以稀釋液代替供試液，不加菌液，其余操作同試驗組。觀察其菌落形態。試驗組和菌液對照組大腸埃希菌24 h試驗菌生長良好，供試品對照組24 h無菌生長，陰性對照組無菌生長。可見，采用常規法控制菌能正常檢出，陰性對照未檢出。符合2015年版《中國藥典（四部）》微生物限度檢查控制菌檢查驗證要求，故常規法可用于茵丹顆粒的控制菌檢查。

3 討論

茵丹顆粒在檢查需氧菌總數時，由于組分中黃芩、連翹、地榆、茵陳對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌均有一定的抑制作用[1]。由本研究結果可見，1∶10供試液需氧菌總數測定金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌回收率比值均未達到試驗要求，與文獻[1]報道一致。通過稀釋法能有效清除抑菌成分，達到檢驗目的，保證檢查方法的完整性和可靠性。同時，這4味中藥對大腸埃希菌均有抑制作用，但茵丹顆粒采用常規法能達到試驗要求，考慮茵丹顆粒為水提法，在制備過程中，抑制大腸桿菌的成分濃度未達到有效MIC。其中連翹對大腸埃希菌作用較弱，乙醇提取物作用強于水提取物[15]。經過驗證，茵丹顆粒的微生物限度檢查方法需氧菌總數檢查可采用稀釋法（1∶100），霉菌和酵母菌總數檢查可采用常規法，控制菌檢查采用常規法，試驗菌回收率及控制菌檢查結果均符合規定。