城鎮污泥中神經酰胺的分離純化

董 儀,朱芬芬*,張榮巖,王 鵬,陳佰靈,張冬蕊

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城鎮污泥中神經酰胺的分離純化

董 儀1,朱芬芬1*,張榮巖1,王 鵬2,陳佰靈2,張冬蕊1

(1.中國人民大學環境學院,北京 100872；2.中國人民大學化學系, 北京 100872)

以A2O-MBR工藝的冷凍干燥污泥作為原料,以索氏提取法,獲得污泥中的粗脂;再經硅膠柱層析,以石油醚-乙酸乙酯 100:1, 10:1和7:3 (/)的順序梯度洗脫,利用薄層色譜法,將洗脫液與神經酰胺標準品對比,(石油醚) :(乙酸乙酯)=7:3為合適的洗脫梯度.經Q-Exactive液相色譜-高分辨質譜檢測各組成成分,就峰面積比,經柱層析洗脫前后神經酰胺從60.88%提高到98.34%.最后,用另一種A2O工藝的污泥進行嘗試,柱層析前后神經酰胺從79.06%提高至94.15%.

城鎮污泥；神經酰胺；提??；純化

城鎮污泥是城鎮污水處理廠污水處理過程中產生的副產品,隨著日益嚴格的污水排放標準和污水處理率[1-2]的逐年提高,城鎮污泥的產生量不斷增長.資料顯示,美國干污泥年產量約700萬t[3],歐盟國家日處理污水超過3億m3[4],年產干污泥約1200萬 t,日本年產污泥干基約220萬t[5].2015年,我國濕污泥(80%含水率)全年產量約3359萬t(相當于干基670萬t),已成為繼美國之后的第二大污泥產生大國,隨著新建污水處理廠增多和現有污水處理廠升級改造,這一數字還會繼續快速增長,估計到2020年,全國全年城鎮污水處理廠污泥(80%含水率)產量將達6170萬t[6].污泥的資源化與其中的有機質息息相關,脂類是重要的有機質,在生物細胞中起著異常重要的作用,在本課題組[7]對A2O和MBR 2種市政污水處理工藝中污泥主要脂類組成的研究中,作為鞘酯中的一大類——神經酰胺(ceramide),其含量(2.82%)要遠遠高于其他的各種脂類的含量,是細胞脂類中資源化潛力最大的成分.

神經酰胺,即N-脂?；拾贝?是由長鏈鞘氨醇與脂肪酸經酰胺鍵縮合而成的生物活性物質,作為鞘脂類的基本構成單位之一,存在于動植物細胞中.神經酰胺具有屏障、粘合、保濕、提高免疫和防癌抗癌的功能[8-10],此外,高效保濕作用使其成為各類化妝品公司市場產品的重要有效成分,開拓了神經酰胺的應用價值.目前,神經酰胺的制造途徑主要包括生物工程、有機合成和天然來源提取分離.生物工程上,利用鞘磷脂酶解法制備神經酰胺[11],或通過酵母菌株發酵制得神經酰胺[12].有機合成根據其手性源的不同,可將合成方法分為3類:以絲氨酸為起始原料構建神經鞘氨醇的立體結構;以碳水化合物作為天然手性源構建神經鞘氨醇的立體結構;以-內酰胺等作為天然手性源構建神經鞘氨醇的立體結構[11].相對于生物工程和有機合成,從自然生物中提取分離目前仍然是獲取神經酰胺的主要方式[13].有研究者利用海洋生物[14]、米糠[15]、小麥[16]、魔芋[17-18]、羊毛[19]等天然來源提取神經酰胺,但植物來源的神經酰胺含量不高(0.15%~0.2%)[20-21],而且,為了得到這些原料還需要支付費用.城鎮污泥中神經酰胺含量(2.82%)豐富,并且廉價又源源不斷,因此污泥中神經酰胺資源化的前景引人注目.

本文以“A2O+MBR工藝混合污泥”為主要研究對象,探索“干化-索氏提取-柱層析”技術路線分離純化神經酰胺的可行性.最后與A2O工藝污泥分離純化神經酰胺比較,探尋處理工藝可能造成的影響.

1 材料與儀器

城鎮污泥:(1)北京市某污水處理廠WWTP(Ⅰ) A2O和MBR工藝的混合污泥.(2)北京市某污水處理廠WWTP(Ⅱ) A2O工藝中來自初沉池和二沉池的混合污泥.

圖1 污水處理廠WWTP(Ⅰ) A2O-MBR工藝流程

圖2 污水處理廠WWTP(Ⅱ)A2O工藝流程

表1 污泥基本性質

正己烷(純度395%)、乙醇(純度399.5%)、石油醚(沸程60~90℃)、乙酸乙酯(純度399.5%)等試劑都是分析純級別,購自北京化工廠;柱層析硅膠,200~ 300目,購于青島海洋化工廠;HSGF254薄層色譜硅膠預制板(煙臺市化學工業研究所,中國);玻璃層析柱,46′203mm(北京欣維爾玻璃儀器公司,中國); WGLL-45BE鼓風干燥箱;索式提取器,Q-Exactive液相色譜-高分辨質譜.

2 方法

2.1 泥樣制備

脫水污泥經真空冷凍干燥48h后,置于振動磨上,調節振動磨時間為2min;泥樣磨碎后,貯存于白色聚四氟乙烯瓶中,于4℃冰箱中備用.

2.2 提取與純化方法

干污泥首先經索氏提取得到污泥中的粗脂,之后將粗脂置于硅膠柱中,進行梯度洗脫,將不同梯度洗脫流出液用薄層色譜(TLC)初步檢測該流出液中是否含有神經酰胺.最后,對目標流出液進行Q- Exactive液相色譜-高分辨質譜(Q-Exactive UHPLC-MS)分析.

2.2.1 提取 索式提取需要的溶劑量小,操作簡便,直接對萃取劑進行加熱,從根本上保證了能量的快速傳導和充分利用.為了獲得神經酰胺粗品,首先提取城鎮污泥中的粗脂.

提取率(%)=[粗脂(g)/干污泥(g)]×100% (1)

準確稱取10g干泥樣(精確至0.001g),置于索氏提取器中,圓底燒瓶內加入一定量的正己烷-乙醇(/,1:1),于80℃下水浴加熱提取8~10h后,提取液經旋轉蒸發器濃縮,得棕色膏狀粗脂,提取率為(4.9±0.14)%.

2.2.2 分離純化 粗脂經硅膠柱層析分離純化,按順序分別用表2中的梯度洗脫,各梯度洗脫至少5次,流速5~8mL/min.收集分離后的目標組分,得神經酰胺樣品.

硅膠柱裝柱時,先用石英棉、石英砂墊底,防止硅膠泄露;然后將約40g的硅膠混合于一定量的石油醚中,濕法裝柱,趕出柱中所有的氣泡;最后覆蓋上一層厚度1cm的石英砂.

2.2.3 神經酰胺的定性檢測 神經酰胺的定性檢測采用薄層色譜分析(TLC分析),使用前將硅膠板置于100~105℃烘箱活化0.5~1h.用內徑0.3mm毛細點樣管吸取一定量的提取液,在硅膠板距底端1cm處進行點樣(圖3).

將神經酰胺標準品和已制好的樣品在同一薄層硅膠板上點樣,用合適的展開劑使初始狀態位于同一位置的組分在薄層硅膠板上展開至不同的位置.標準品和樣品分別使用茜素顯色劑(0.1%茜素溶液)和磷鉬酸顯色劑(10%磷鉬酸溶液),進行浸漬顯色,觀察結果.

分別用(1)乙酸乙酯-乙酸(100:1,/);(2)正己烷-乙酸乙酯(3:1,/); (3)氯仿-甲醇-乙酸(19:0.9:0.1,//),乙酸乙酯-乙酸(100:1,/)二次展開;(4)氯仿-甲醇(95:5,/);(5)氯仿-甲醇-乙酸(19:0.9:0.1,//)作展開劑,以磷鉬酸溶液做顯色劑,觀察結果.

2.2.4 柱層析過程神經酰胺分析 分析采用超高效液相色譜與Q-Exactive 臺式四極桿—軌道阱高分辨質譜儀結合的儀器.

液相條件:色譜柱為Cortecs C18柱(100×2.1mm,1.6μm,waters);柱溫:40℃;流速: 220μL/min;進樣體積:2μL;流動相:A:乙腈:水(60: 40)10mmol/L的醋酸銨,B:異丙醇:乙腈(90:10) 10mmol/L的醋酸銨,梯度洗脫.

質譜條件:離子化方式:正離子模式;噴霧電壓: 3800V(正離子模式);氣化溫度:300℃;鞘氣壓(N2): 35arb;輔助氣壓(N2):10arb;離子傳輸管管溫度:320℃;掃描范圍:正離子/240~2000;二級質譜: 基于母離子列表的數據依賴采集(R17500).

3 結果與討論

3.1 污泥分離純化神經酰胺的可行性分析

3.1.1 顯色劑的選擇 茜素是胺類物質的專屬性顯色劑,磷鉬酸是一般有機化合物的通用顯色劑.從圖3中可以看出,茜素溶液的顯色效果不明顯,對神經酰胺標準品不顯色.用磷鉬酸溶液形成的點比較清晰,重現性比較好,適合用作顯色劑.

圖3 顯色劑的對比

左邊為茜素溶液顯色;右邊為磷鉬酸溶液顯色“S”代表污泥粗脂樣品,“標”代表神經酰胺標準品

3.1.2 展開劑的選擇 從圖4(a)中看出,乙酸乙酯-乙酸(100:1,/)、正己烷-乙酸乙酯(3:1,/)、氯仿-甲醇-乙酸(19:0.9:0.1,//),乙酸乙酯-乙酸(100:1,/)二次展開的條件下,粗脂樣品中各成分并沒有明顯分離開,拖尾嚴重.在圖4(b)中,相對于氯仿-甲醇-乙酸(19:0.9:0.1,//),氯仿-甲醇(95:5)作展開劑時,斑點界限更清晰,各成分的分離效果較好.

(a)從左至右分別為 (1)乙酸乙酯-乙酸(100:1,/);(2)正己烷-乙酸乙酯(3:1,/);(3)氯仿-甲醇-乙酸(19:0.9:0.1,//),乙酸乙酯-乙酸(100:1,/)二次展開;(b)從左至右分別為 (4)氯仿-甲醇(95:5,/);(5)氯仿-甲醇-乙酸(19:0.9:0.1,//)作展開劑

3.1.3 柱層析結果 柱層析時,用不同洗脫梯度的溶劑洗脫粗脂中的各種組分,用薄層色譜(TLC)檢測各種組分中是否含有神經酰胺的部分.

表2 粗脂柱層析分離時的梯度洗脫順序

注:洗脫順序中的數字代表用1×10cm的試管承接洗脫流出液時,間隔大約50mL流出液時計數一次,并在薄層硅膠板上點樣一次.

從圖4(b)中可以看出有粗脂中在神經酰胺物質的極性附近包含4種成分(①②③④),和神經酰胺標準品對比后,初步判斷第④種組分為柱層析分離時的目標產物.

用不同極性的石油醚-乙酸乙酯進行洗脫(表2),結果如圖5所示.洗脫梯度為石油醚:乙酸乙酯 200:1, 180:1, 160:1, 140:1, 120:1和100:1 (/)時,從粗脂中分離出的組分均為弱極性物質.洗脫梯度為石油醚-乙酸乙酯80:1, 60:1, 40:1, 20:1和10:1 (/)時,洗脫出極性大小接近待分離的目標產物物質,即圖4中標記的①②③成分.當石油醚-乙酸乙酯 9:1, 8:2和7:3 (/)洗脫時,從流出液中檢測到目標產物.硅膠柱為正相柱,相對強極性的洗脫劑可以將樣品中的弱極性物質洗脫出來,則可以將洗脫梯度簡化為石油醚-乙酸乙酯100:1, 10:1和7:3 (/).

3.2 A2O-MBR工藝污泥分離純化神經酰胺

將污水處理廠WWTP(Ⅰ) A2O-MBR工藝污泥索氏提取得到的粗脂分別經石油醚、乙酸乙酯梯度洗脫,通過薄層色譜(TLC)檢測(圖6),當洗脫梯度為石油醚-乙酸乙酯7:3(/)時,收集流出液.粗脂和神經酰胺產物經Q-Exactive UPLC-MS檢測后的總離子流色譜圖如圖7所示.從原粗脂和分離提純后產物的各組成成分峰面積比例圖(圖8)可以看出,神經酰胺由污泥原粗脂的(60.88±11.0)%,經柱層析后得到的分離提純后產品提高到(98.34±0.19)%.這說明柱層析分離純化粗脂中的神經酰胺是可行的.

注:“S”代表污泥粗脂樣品,“標”代表神經酰胺標準品,數字1~42均代表柱層析的洗脫流出液

表3 脂類大致分類

表4 神經酰胺色譜表(正離子模式)

注:表中為峰面積排列在前20的神經酰胺種類.

圖8 WWTP(Ⅰ) A2O-MBR污泥中脂類和神經酰胺產物的各組成成分峰面積比例

3.3 A2O工藝污泥分離純化神經酰胺

注:“S”代表污泥粗脂樣品,“標”代表神經酰胺標準品,數字1~87均代表柱層析的洗脫流出液

由污泥樣品(I)的分離提純結果可知本研究使用的方法可行,所以,將該方法應用于污泥樣品(II).

圖10 WWTP(Ⅱ) A2O污泥中粗脂和神經酰胺產物的總離子流色譜圖(正離子模式)

從圖11結果可以看出,WWTP(Ⅱ)A2O污泥粗脂中神經酰胺(79.06%)更高,但是經過本文的分離提純后的樣品中神經酰胺并沒有WWTP(Ⅰ) A2O-MBR污泥分離提純后高.這可能是2個污泥樣品中各種成分來源有區別導致的.由圖1工藝流程圖可以看出WWTP(Ⅱ)A2O污泥由2部分組成—初沉池污泥和二沉池污泥,初沉池污泥主要來源于污水中的懸浮顆粒(大部分為有機顆粒)以及顆粒上吸附的成分,二沉池污泥則主要由生物池(A2O中好氧池的微生物)組成;而WWTP(Ⅰ)A2O-MBR污泥,因為污水處理工藝沒有初沉池,其來源則只有MBR池中的微生物以及一些被微生物絮體包裹攔截的一小部分污水中的懸浮顆粒.所以從來源來說,A2O- MBR污泥的成分會相對單一一些,所以分離純化后能得到更高的神經酰胺.同時,也說明本研究的分析提純方法針對不同污水處理工藝還有提升空間.

圖11 WWTP(Ⅱ) A2O污泥中脂類和神經酰胺產物的各組成成分峰面積比例

4 結論

4.1 通過索氏提取-硅膠柱層析法,實現城鎮污泥中神經酰胺的分離純化是可行的.以A2O-MBR污泥為例,過程如下:(1) 80℃下,索氏提取污泥粗脂,提取劑為正己烷-乙醇1:1(/);(2)對粗脂進行柱層析洗脫.且石油醚-乙酸乙酯7:3()洗脫時獲得最多的神經酰胺.正己烷、乙醇作為提取劑,石油醚、乙酸乙酯作為洗脫劑,安全性較高.

4.2 不同來源污泥的成分會影響神經酰胺分離提純結果.A2O-MBR污泥成分相對A2O污泥更單一,分離純化后能得到更高的神經酰胺.該方法針對不同污水處理工藝還有提升空間.

4.3 索氏提取-硅膠柱層析法分離純化神經酰胺,其經濟可行性還需要通過技術優化以及放大試驗后論證.有可能使得成本過高的原因有以下幾點:污泥干化和索氏提取時的能耗,以及提取溶劑、柱層析洗脫劑的物耗.對應可做以下優化以降低成本,嘗試使用濕污泥直接索氏提取,優化索氏提取的工藝參數(如時間、固液比)、試劑回收再利用等.

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致謝：本實驗神經酰胺的超高效液相色譜與Q Exactive臺式四極桿——軌道阱高分辨質譜檢測工作由清華大學代謝組學平臺協助完成,在此表示感謝.

Preliminary study on extraction and purification of ceramide in sewage sludge.

DONG Yi1, ZHU Fen-fen1*, ZHANG Rong-yan1, WANG Peng2, CHEN Bai-ling2, ZHANG Dong-rui1

(1.School of Environment & Natural Resources, Renmin University of China, Beijing 100872, China；2.Department of Chemistry, Renmin University of China, Beijing 100872, China)., 2019,39(5)：2063~2070

Using the freeze-dried sludge of A2O-MBR process as raw material, we firstly obtained the crude lipid in the sludge by Soxhlet extraction. Then the crude lipid was eluted in a sequence of petroleum ether-ethyl acetate 100:1, 10:1 and 7:3 () by silica gel column chromatography. Compared the eluent with ceramide standard by thin layer chromatography, it was proved that the appropriate elution gradient was petroleum ether-ethyl acetate 7:3 (). Through Q Exactive bench quadrupole orbitrap high-resolution mass spectrometry, the peak area ratio of ceramide was increased from 60.88% to 98.349% in the process of column chromatography. When the sludge of A2O process was used as raw material in the same experiment, the peak area ratio of ceramide was increased from 79.06% to 94.15%.

sewage sludge；ceramide；extraction；purification

X703

A

1000-6923(2019)05-2063-08

董 儀(1993-),女,湖北咸寧人,碩士,研究方向為固體廢棄物處理處置.發表論文2篇.

2018-10-29

北京市自然科學基金資助項目(8172029)

*責任作者, 副教授, zhufenfen@ruc.edu.cn