魯氏接合酵母產葡萄糖醛酸發酵條件優化

李益烽，方芳*

1(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 2(食品科學與技術國家重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

葡萄糖醛酸(glucuronic acid，GlcUA)又稱葡糖醛酸、葡醛酸，分子式C6H10O7，分子質量為194.14，能溶于水，微溶于乙醇。葡萄糖醛酸存在于多種動植物中，它是葡萄糖C-6位上的羥基被氧化而形成的羧酸[1]。在人體和動物中，葡萄糖醛酸以尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(uridine diphosphate glucuronic acid，UDP-GlcUA)的活性供體形式存在。微生物可以通過肌醇氧化途徑氧化肌醇生成葡萄糖醛酸[2]，有些微生物則合成細胞外結合型葡萄糖醛酸，即胞外多糖[3-5]。葡萄糖醛酸可以與人體內的多種毒素結合后排出體外，因而可以作為一種解毒劑[6]。此外，人體每天攝入適量的葡萄糖醛酸可以有效地預防多種退行性疾病[7]。D-葡萄糖醛酸也是構成肝素、軟骨素，透明質酸等功能營養化學品的單體之一[8]。因此，葡萄糖醛酸被廣泛應用于醫藥，化妝品，保健食品等領域[7,9]。

目前工業化生產葡萄糖醛酸主要是采用濃硝酸氧化淀粉的化學合成法[9]?；瘜W合成法成本低，但是反應體系復雜，氧化選擇性較差且氧化程度無法有效控制，因此存在副反應多、產物分離困難等問題[9]。根據上述缺點，研究者進行了工藝和條件的改進：林培喜等改用堿法水解減少污染[10]；郭耀基等從廢液中二次回收增加了產品的回收率[11]；房媛通過超聲波預處理，以芬頓試劑為氧化劑，并結合酶法清潔生產葡萄糖醛酸及內酯[12]。但淀粉氧化法仍存在各種限制性因素，因此必須尋找更加綠色高效的方法。利用微生物法生產葡萄糖醛酸目前處于初步研究階段，用于合成葡萄糖醛酸的菌株有限，產量也較低。由于葡萄糖醛酸是葡萄糖二酸合成的前體，構建大腸桿菌基因工程菌合成葡萄糖二酸的過程，也實現了葡萄糖醛酸的生物合成[2,13-14]。在大腸桿菌中通過構建肌醇氧化途徑以及過量表達肌醇氧化酶(myo-inositol oxidase，MIOX)，使得葡萄糖醛酸產量達到3.94 g/L[13-23]。此外，也有研究者利用酶法降解微生物發酵產生的多糖或多糖醛酸獲得葡萄糖醛酸。但是由于酶的特異性問題和對多糖降解的不充分性，獲得的產物為不飽和葡萄糖醛酸單體、二聚體和三聚體，該方法仍處于研究階段[4]。

本研究旨在篩選一株具有合成葡萄糖醛酸潛力的菌株，并通過單因素發酵條件優化，補料方法考察，初步提高發酵法合成葡萄糖醛酸的水平。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑和培養基

菌株：AspergillusoryzaeNRRL3448，購自中國微生物菌種保藏中心；其余菌株均為本研究室保藏，其中ZygosaccharomycesrouxiiZSR2，BacilluscereusH3，BacilluscereusH4，BacilluscereusH7均分離自紅茶菌，CandidaorthopsilosisY3分離自醬油醬醪。

葡萄糖、蔗糖、大豆蛋白胨、KH2PO4、檸檬酸銨均購自國藥集團股份有限公司；蛋白胨和酵母提取物購自Oxoid公司；葡萄糖醛酸標樣購自Solarbio公司。

種子培養基(g/L)：酵母提取物5，蛋白胨20，葡萄糖20。固體培養基加入20瓊脂?；A發酵培養基(g/L)：葡萄糖20，大豆蛋白胨10，KH2PO41.5。

1.2 儀器與設備

ZQZY-VAF振蕩培養箱，上海知楚儀器有限公司；HH-B11·420BS恒溫培養箱，上海躍進醫療器械有限公司；ICS-5000離子色譜儀，賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養方法

種子培養：挑取單菌落接種于含 50 mL種子培養基的250 mL錐形瓶中，30 ℃、220 r/min培養10 h。搖瓶發酵培養：將種子培養液按1%的接種量接種到含50 mL發酵培養基的250 mL錐形瓶中，30 ℃、220 r/min培養20 h。單因素優化后以最佳條件培養。

1.3.2 菌株篩選方法

根據菌株肌醇氧化酶活性進行篩選，挑選酶活力較高的菌株，驗證其產葡萄糖醛酸的能力，選擇合適菌株進行后續研究。本方法中使用的培養基包括：真菌篩選培養基(g/L)：酵母提取物5，葡萄糖20，蛋白胨20；細菌篩選培養基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5。

1.3.3 肌醇氧化酶酶活測定

以肌醇為底物，通過酶轉化肌醇生成葡萄糖醛酸的方法測定MIOX的活性[2]。酶活定義：1 min內生成1 μmol醛酸所需要的酶量為1個酶活力單位。酶催化反應：向900 μL含有50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，2 mmol/LL-半胱氨酸，1 mmol/L Fe(NH4)2(SO4)2和10 g/L肌醇的反應液中添加100 μL酶液，30 ℃反應1 h，加入100 μL的 30%三氯乙酸終止反應。取1 mL反應液，加入2 mL苔黑素試劑(每10 mL 濃鹽酸中加入40 mg苔黑素，10 mg FeCl3)，沸水中反應15 min，冷卻后測定670 nm處吸光度。酶活以每克干菌體表示，即U/ g (DCW)。菌體干重測定：取10 mL培養液離心收集菌體，用無菌水洗滌2次，烘干至恒重稱重并計算菌體凈重。

1.3.4 葡萄糖醛酸含量測定

葡萄糖醛酸含量的測定采用改良的離子色譜法[19,24]。發酵液用超純水稀釋100倍，用0.22 μm微孔濾膜過濾后用離子色譜測定。以質量濃度為0.1 g/L 的葡萄糖醛酸為標準品。

色譜條件：分離柱為IonPacAS11-HC (4×250 mm)，保護柱使用IonPacAG11-HC (4×50 mm)。淋洗液發生器(淋洗梯度設置)：0～15 min，0.8 mmol/L；15～27 min，0.8～12 mmol/L；27.1～31 min，45 mmol/L；31.1～35 min，0.8 mmol/L；流速：1.00 mL/min；柱箱溫度：30 ℃；進樣量為25 μL，檢測使用抑制型電導，AERS 5004 mm。

1.3.5 單因素優化

培養基碳氮源優化：本研究中用于培養基組成優化的碳源包括葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖、山梨醇和甘露醇；氮源包括蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、尿素、硫酸銨、檸檬酸銨。

碳氮源優化使用的培養基如下：碳源種類優化培養基(g/L)：大豆蛋白胨10，KH2PO41.5，碳源含量為20 g/L(以葡萄糖計，其他碳源以相同碳摩爾數計)；碳源濃度優化培養基(g/L)：大豆蛋白胨10，KH2PO41.5，蔗糖20～120；氮源種類優化培養基(g/L)：葡萄糖20，KH2PO41.5，氮源含量為10 g/L(以大豆蛋白胨計，其他氮源以相同氮摩爾數計)；氮源濃度優化培養基(g/L)：葡萄糖20，KH2PO41.5，大豆蛋白胨質量濃度10～40 g/L。

發酵培養基初始pH、種齡和接種量優化：本研究中的培養條件優化包括培養基初始pH、種齡和接種量，其中初始pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0, 種齡分別為6、7、8、9、10 h，接種量分別為1%、3%、5%、7%、10%。

1.3.6 發酵液中蔗糖含量測定

蔗糖標準曲線的制作：取蔗糖標準溶液(稱取1 g蔗糖，超純水溶解，稀釋到100、200、300、400、500 mg/L) 0.9 mL，加入2 mol/L NaOH 0.1 mL，100 ℃沸水浴10 min， 立即冷卻。再加入間苯二酚試劑(稱取0.1 g 間苯二酚，用6 mol/L HCl溶解，定容至100 mL)1 mL，10 mol/L HCl 3 mL，混勻，80 ℃水浴8 min，冷卻至室溫。在500 nm波長下測吸光度。

樣品中蔗糖含量測定：取稀釋至適當倍數發酵液0.9 mL，操作同上。以蒸餾水作為空白對照。根據標準曲線，計算出樣品中蔗糖含量。

1.3.7 發酵液中氮含量檢測

根據食品安全國家標準食品中蛋白質的測定中凱氏定氮法檢測發酵液中氮的含量[25]。

1.3.8 補料方法考察

補料種類考察：魯氏接合酵母ZSR2發酵至對數中后期(14 h)，向培養基中補加大豆蛋白胨(10 g/L)，以等量無菌水作為對照。每隔2 h取樣，檢測發酵液中菌體濃度和葡萄糖醛酸含量。

補料濃度考察：魯氏接合酵母ZSR2發酵至對數中后期(14 h)，向培養基中補加大豆蛋白胨(5～30 g/L)，以等量無菌水作為對照。每隔2 h取樣，檢測發酵液中菌體濃度和葡萄糖醛酸含量。

復合氮源配比考察：魯氏接合酵母ZSR2發酵至對數中后期(14 h)，向培養基中補加不同配比復合氮源(以氮含量計，大豆蛋白胨氮含量為10%)，其中有機氮源使用大豆蛋白胨，無機氮源使用檸檬酸銨，以等量無菌水作為對照。每隔2 h取樣，檢測發酵液中菌體濃度和葡萄糖醛酸含量。

2 結果與分析

2.1 產葡萄糖醛酸菌株的篩選

微生物合成葡萄糖醛酸途徑的關鍵酶為肌醇氧化酶。根據菌株肌醇氧化酶活性的高低以及菌株產酸水平，可以初步選擇用于發酵法生產葡萄糖醛酸的菌株。本研究比較了來源于紅茶菌和醬醪及實驗室保藏的菌株，發現肌醇氧化酶酶活較高的菌株有蠟樣芽孢桿菌H4,蠟樣芽孢桿菌H7，魯氏接合酵母ZSR2，蠟樣芽孢桿菌H3，米曲霉NRRL3448，魯氏接合酵母ZQ01，假絲酵母Y3(圖1-A)。但由于菌株肌醇氧化酶活力高低和產葡萄糖醛酸能力高低不具有絕對相關性，產葡萄糖醛酸的能力可能還與肌醇氧化途徑其他酶酶活、菌株代謝利用葡萄糖醛酸能力等相關，因此還需要檢測菌株產葡萄糖醛酸能力。發酵液中葡萄糖醛酸產量最高的菌株是魯氏接合酵母ZSR2，其合成葡萄糖醛酸的水平為1.13 g/L (圖1-B)。由于魯氏接合酵母ZSR2在合成葡萄糖醛酸能力和關鍵合成酶水平方面具有相對優勢，選擇它為生產菌株進行葡萄糖醛酸發酵條件優化研究。

A-菌株肌醇氧化酶酶活比較；B-菌株產葡萄糖醛酸能力比較圖1 菌株肌醇氧化酶酶活和葡萄糖醛酸產量比較Fig.1 The comparison of MIOX activity and glucuronic acid yield between strains

2.2 魯氏接合酵母發酵產葡萄糖醛酸單因素優化

2.2.1 發酵培養基碳源優化

對發酵培養基碳源進行優化，結果見圖2。在考察的7種碳源中，魯氏接合酵母ZSR2以蔗糖和甘露醇作為碳源，可以獲得較高產量的葡萄糖醛酸，分別為3.94 和4.06 g/L。但蔗糖與甘露醇相比具有價格優勢，因此選擇蔗糖作為發酵用碳源。對蔗糖濃度研究發現，當蔗糖質量濃度為80 g/L時，魯氏接合酵母ZSR2產葡萄糖醛酸產量達到最高，為7.97 g/L。

A-碳源種類對魯氏接合酵母產GlcUA影響；B-蔗糖質量濃度對魯氏接合酵母產GlcUA影響圖2 碳源對魯氏接合酵母ZSR2產GlcUA影響Fig.2 Effect of carbon sources on production of GlcUA by Z. rouxii ZSR2

2.2.2 發酵培養基氮源優化

對發酵培養基的氮源種類研究顯示，魯氏接合酵母ZSR2發酵產葡萄糖醛酸的最佳氮源為大豆蛋白胨。并且，當大豆蛋白胨質量濃度為30 g/L時，產酸量最高，達到8.65 g/L (圖3)。

A-氮源種類對產GlcUA影響；B-大豆蛋白胨對產GlcUA影響圖3 氮源對魯氏接合酵母ZSR2產GlcUA影響Fig.3 Effect of nitrogen sources on production of GlcUA by Z. rouxii ZSR2

2.2.3 發酵培養基初始pH優化

魯氏接合酵母的最適生長pH在5.0～5.5[26]。對紅茶菌產葡萄糖醛酸的研究表明，弱酸環境可在一定程度上促進葡萄糖醛酸的合成[21]。為尋找有利于葡萄糖醛的發酵條件，考察了發酵培養基初始pH對魯氏接合酵母ZSR2產葡萄糖醛酸的影響。由圖4可以看出，當發酵培養基初始pH為5.0時，魯氏接合酵母ZSR2產葡萄糖醛酸產量最高，為11.68 g/L。發酵培養基初始pH低于5.0時以及偏中性的培養條件均不利于產酸。

圖4 初始pH對魯氏接合酵母ZSR2產GlcUA影響Fig.4 Effect of initial pH on production of GlcUA by Z. rouxii ZSR2

2.2.4 最適接種量和種齡的確定

對魯氏接合酵母ZSR2產葡萄糖醛酸種齡和接種量的研究表明，接種量為3%，種齡為9 h時，ZSR2產葡萄糖醛酸產量達到最高(圖5)。通過優化種齡和接種量，魯氏接合酵母ZSR2產葡萄糖醛酸水平提高到13.02 g/L。在此基礎上，通過監測魯氏接合酵母ZSR2發酵產葡萄糖醛酸的過程發現，產酸量最高為魯氏接合酵母ZSR2生長的穩定期。此時，菌體濃度(OD600) 達到11.6，葡萄糖醛酸產量為14.68 g/L，是優化前的3.8倍(圖6)。

A-接種量對產GlcUA的影響；B-種齡對產GlcUA的影響圖5 接種量和種齡對魯氏接合酵母ZSR2產GlcUA影響Fig.5 Effect of inoculum size and age on production of GlcUA by Z.rouxii ZSR2

圖6 魯氏接合酵母ZSR2產GlcUA發酵過程曲線Fig.6 The fermentation process curve of glucuronic acid by Z. rouxii ZSR2

2.3 補料策略促進魯氏接合酵母產葡萄糖醛酸

前期研究證實，魯氏接合酵母生長與葡萄糖醛酸的合成是偶聯的。對魯氏接合酵母產葡萄糖醛酸發酵過程培養基中碳源和氮源分析表明，發酵后期菌體生長和產酸減緩，此時培養基中碳源充足而氮源不足(圖7)。因此，確定采用補加氮源的方法促進產酸。由于16 h時菌體生長已進入穩定期，此時培養基中氮源已消耗至50%以下，因此選擇在發酵第14 h補加氮源。由圖8可以看出，在發酵第14 h補加有機氮源大豆蛋白胨，可以同時促進菌體生長及葡萄糖醛酸的合成。在發酵過程中，向培養基中補加20 g/L大豆蛋白胨后，菌體量和葡萄糖醛酸產量均為最高；發酵24 h時菌體OD600達到14.65，葡萄糖醛酸產量提高到18.15 g/L，比對照提高22.7%。

圖7 魯氏接合酵母ZSR2產GlcUA發酵過程碳氮源含量變化Fig.7 The change of carbon and nitrogen sources during fermentation on GlcUA production by Z.rouxii ZSR2

A-補加氮源對菌體生長的影響；B-補加氮源對產GlcUA的影響圖8 補加氮源對魯氏接合酵母ZSR2生長及產GlcUA影響Fig.8 The effect of nitrogen source feeding on growth of Z.rouxii ZSR2 and GlcUA synthesis

在實際工業生產中，增加培養基中有機氮源的含量會造成生產成本的增加。無機氮源成本較低，并且同有機氮源比是相對利用緩慢的氮源。因此，添加無機氮源對于降低生產成本有重要意義，也可能促進產酸。通過比較采用復合氮源或無機氮源補料對魯氏接合酵母ZSR2產葡萄糖醛酸的影響發現，采用無機氮源檸檬酸銨不僅有利于魯氏接合酵母ZSR2生長，也促進了其產酸。從圖9可看出，隨著復合氮源中檸檬酸銨的比例增加，菌體的生長加快、葡萄糖醛酸產量也不斷提高。當復合氮源全為檸檬酸銨(11.56 g/L)時，菌體量在16 h達到最大，葡萄糖醛酸產量在20 h達到最高，為22.36 g/L，比對照高了49.9%。分析原因可能為魯氏接合酵母ZSR2發酵產葡萄糖醛酸是一個產酸的過程，發酵液pH會不斷下降，而過低的pH會抑制菌體的生長以及降低相關酶系的活力，而檸檬酸銨相比于大豆蛋白胨，除了為菌體提供營養物質，還可以起到中和緩沖的作用，從而維持發酵液pH的穩定，促進魯氏接合酵母ZSR2生長和產酸。

A-不同復合氮源對菌體生長的影響；B-不同復合氮源對產GlcUA的影響圖9 補加氮源策略對魯氏接合酵母ZSR2生長及產GlcUA影響Fig.9 The effect of nitrogen source feeding strategies on growth of Z.rouxii ZSR2 and GlcUA synthesis

3 結論

本研究以1株具有合成葡萄糖醛酸潛力的魯氏接合酵母ZSR2為生產菌株，通過發酵條件的單因素優化，使葡萄糖醛酸產量從3.85 g/L提高到14.68 g/L，是優化前的3.8倍。然后通過在發酵中期補加氮源的方式，使魯氏接合酵母合成葡萄糖醛酸的產量進一步提高到22.36 g/L，是目前報道的純菌發酵產葡萄糖醛酸的最高水平。研究結果可為微生物發酵法生產葡萄糖醛酸的工業化進程奠定基礎。