β-葡聚糖對傳統青稞酒發酵的影響

游茂蘭，鄧婧，覃小麗，金劍波，葉正榮，易川虎，劉雄,*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(昌都市農業科學研究所，西藏 昌都， 854000) 3(昌都君親農業科技開發有限公司，西藏 昌都，854000)

青稞是西藏地區的特色農作物，除加工傳統糌粑外，多用于釀造青稞酒[1]。青稞酒是青藏高原的特色產品，距今已有2 000多年的歷史[2]。據報道，2015年西藏青稞產量為70.85萬t，而用于釀酒的青稞高達13萬t[3]。西藏傳統青稞酒的釀造是以蒸煮攤涼后的青稞為原料，加入酒曲糖化后裝罐密封發酵而成[4]。釀造過程中青稞淀粉的分解率和利用效率是影響青稞出酒率的關鍵因素。本課題組發現青稞β-葡聚糖形成的高黏性環境會抑制淀粉的體外消化分解，且隨β-葡聚糖分子質量和濃度的增大抑制效果越明顯[5]。葉海生等[6]發現在糖化過程中釋放的大量β-葡聚糖會影響麥汁或啤酒的過濾速度、酒體的穩定性及清晰度等。近年來，青稞酒的研究多集中于發酵工藝[7-9]、酒體風味特征[10-11]和菌種分析及篩選[12-14]等方面，關于β-葡聚糖對淀粉發酵影響的研究鮮見報道。此外，傳統青稞酒釀造過程中存在的淀粉發酵效率低、產酒量低和酒品參差不齊等問題是否與β-葡聚糖含量有關尚未可知。

基于上述問題，本文以青稞為原料釀制傳統青稞酒，并研究釀造過程中的總糖、β-葡聚糖和乙醇等成分的動態變化規律，以及青稞酒和青稞酒糟的營養組分的變化。并采用青稞淀粉和不同濃度梯度的β-葡聚糖模擬釀造工藝，分析不同濃度的β-葡聚糖對淀粉分解率、還原糖生成量和乙醇產量等的影響，從而探究β-葡聚糖對傳統青稞酒發酵的影響，以期為提高傳統青稞酒產量和改善其釀造品質提供基礎理論依據和科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青稞，由西藏昌都市君親農業科技開發有限公司提供；安琪釀酒曲，湖北安琪酵母股份有限公司；交聯β-葡聚糖測定試劑盒，愛爾蘭Megazyme公司；AAS18氨基酸混標、FNO6988水合茚三酮，購于國家標準物質標準樣品信息中心；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HWS恒濕恒溫培養箱，浙江寧波江南儀器廠；4K15型高速離心機，德國Sigma公司；UV-2450型紫外分光光度計，日本島津公司；日立L-8900全自動氨基酸分析儀，日本日立公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 傳統青稞酒釀造工藝

傳統青稞酒的釀造工藝基于文獻[4,15-16]進行了改進。取適量青稞，洗凈后浸泡過夜，于常壓蒸煮90 min，當青稞籽粒吸水膨脹開裂(吸水率在150%～155%)、軟硬適度即可。冷卻至30 ℃后按煮前青稞質量的0.4%添加酒曲，裝罐密封，并于30 ℃恒溫發酵箱中發酵72 h。發酵結束后，在酒醅中按1∶1.5 (g∶mL)的比例添加涼開水，浸泡12 h后用兩層紗布過濾，濾液即為青稞酒。

1.3.2 基本組分測定

β-葡聚糖采用NY/T 2006—2011《谷物及其制品中β-葡聚糖含量的測定》[17]；還原糖采用GB 5009.7—2016《食品安全國家標準食品中還原糖的測定》[18]；淀粉采用GB 5009.9—2016《食品安全國家標準食品中淀粉的測定》[19]；酒醅中酒精度測定采用重鉻酸鉀比色法[20]；青稞酒酒精度測定采用GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》[21]；酸度和可溶性固形物測定采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[22]；總糖含量是將樣品水解后按還原糖方法測定。

1.3.3 青稞、青稞酒糟和青稞酒中氨基酸測定

青稞、青稞酒糟氨基酸測定：參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》[23]。青稞酒中氨基酸測定基于文獻[24-26]進行改進，即取5 mL青稞酒于20 mL的水解管中，添加5 mL質量濃度為0.08 g/L 5-磺基水楊酸，混勻，并于4 ℃靜置22 h；振蕩水解管以混勻樣液，取5 mL樣液于離心管中并離心(8 000 r/min，20 min)，取1 mL上清液于25 mL容量瓶中，用0.02 mol/L鹽酸溶液稀釋并定容，取適量稀釋液過濾(膜孔徑為0.22 μm)，濾液置于進樣小瓶中，上機測定。

1.3.4 青稞β-葡聚糖對淀粉發酵的影響

取6支試管按1～6進行編號，分別添加2 g青稞淀粉和10 mL蒸餾水，然后沸水浴糊化處理10 min； 待其冷卻至室溫，分別加入質量濃度為0、0.02、 0.04、0.06、0.08、0.1 g/mL的β-葡聚糖溶液10 mL，再以青稞淀粉質量的0.4%添加酒曲，并均質混勻，密封后于30 ℃條件下恒溫發酵72 h，其中每次間隔12 h取樣檢測，測定淀粉水解率、還原糖、酒精度和β-葡聚糖的含量在整個發酵過程的變化情況。

另取5支試管并添加10 mL蒸餾水到試管中，然后分別加入質量濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 g/mL的β-葡聚糖溶液10 mL，分別添加0.008 g酒曲(酒曲添加量與實驗組相同)，均質混勻，密封后于30 ℃條件下恒溫發酵72 h，每次間隔12 h取樣檢測，檢測β-葡聚糖含量在整個發酵過程中的變化情況。

1.4 數據分析

本研究中每個試驗重復3次，以平均值±標準偏差來表示試驗結果。同時運用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0分析軟件對數據進行整理與顯著性分析(P<0.05為顯著性差異)，利用Origin 8.5和Microsoft Excel 2010對試驗數據進行圖與表的繪制。

2 結果與分析

2.1 青稞、青稞酒糟和青稞酒的營養組成

由表1可知，與青稞原料相比，酒糟中的淀粉含量明顯降低而蛋白質、粗纖維、總糖、β-葡聚糖的含量均顯著升高(P<0.05)。這可能是因為在傳統釀造過程中青稞淀粉被大量分解并發酵生成酒精，而其他營養成分殘留、富集于酒糟中，從而使得青稞酒糟中除淀粉外的其他營養成分顯著提高。

表1 青稞、青稞酒糟營養成分 單位：g/100 g

注：表中不同小寫字母代表差異顯著,P<0.05。

如表2所示，與已報道的黃酒和日本清酒的基本理化指標相比，傳統青稞酒的總糖、總酸、總固形物和酒精度均低于黃酒，但其總酸和總固形物含量均高于日本清酒，這與杜木英報道的研究結果一致[27]。此外，傳統青稞酒中還含有少量β-葡聚糖。

表2 青稞酒基本理化指標Table 2 Physical and chemical indexes of traditional highland barley wine

注：“-”表示未檢出。

2.2 青稞、青稞酒糟和青稞酒的氨基酸組成

由表3可知，青稞酒中含有11種游離氨基酸，總量為318.43 mg/L；青稞和青稞酒糟均含有17種氨基酸，但青稞酒糟的氨基酸總量(16 570.08 mg/100 g)遠高于青稞中的氨基酸總量(7 671.55 mg/100 g)。結合表1和表3可知，青稞酒糟中氨基酸種類全面且營養豐富，這說明傳統發酵青稞酒的酒糟是一種高營養價值的食品加工副產物，可以進一步加工生產更高附加值的產品。

表3 青稞、青稞酒糟、青稞酒的氨基酸組成Table 3 The amino acids content in highland barley, distillers' grains and wine

2.3 發酵酒醅中酒精度和總糖含量變化情況

如圖1所示，在傳統青稞酒釀造過程中，酒醅的酒精度呈顯著性增高(P<0.05)，在60 h后急劇增加。

圖1 發酵酒醅中總糖含量和酒精度變化情況Fig.1 Change of total sugar content and ethanol content注：圖中不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05。下同。

總糖含量在12～24 h呈上升趨勢，24 h后開始降低，在48～72 h顯著性降低(P<0.05)。這可能是因為青稞中糊化的淀粉在曲霉糖化酶的作用下首先轉化生成可發酵糖，從而反映出總糖含量在12～24 h呈上升趨勢；后期由于酵母菌大量利用可發酵糖轉化為酒精和CO2，使得總糖含量在24～72 h呈下降趨勢。

2.4 發酵酒醅中β-葡聚糖含量變化情況

如圖2所示，在發酵初期(12～24 h)β-葡聚糖含量緩慢下降；在發酵的中、后期(48～72 h)β-葡聚糖含量急劇下降。該變化趨勢可能與青稞淀粉水解的可發酵糖的利用速度有關，在發酵后期可發酵糖絕大部分被分解轉化成乙醇后(圖1結果中48h后總糖急劇減少)，微生物開始加速利用β-葡聚糖，導致后期β-葡聚糖含量急劇下降。

圖2 發酵酒醅中β-葡聚糖含量變化情況Fig.2 Change of highland barley β-glucan content

2.5 青稞β-葡聚糖對淀粉發酵的影響

傳統青稞酒的釀造首先是由曲霉糖化酶將青稞淀粉水解成可發酵糖類，再由酵母菌利用可發酵糖轉化生成酒精。青稞中β-葡聚糖的存在對酒曲中微生物及其產生的酶水解利用淀粉產生阻礙。因此，采用青稞淀粉和不同濃度梯度的β-葡聚糖來模擬傳統青稞酒的釀造過程，進一步了解β-葡聚糖在青稞酒發酵過程中對淀粉水解和發酵的影響情況。

2.5.1 不同濃度青稞β-葡聚糖對淀粉分解的影響

如圖3所示，在同一發酵時間下β-葡聚糖濃度越高其淀粉的分解率越低。

圖3 不同質量濃度青稞β-葡聚糖與淀粉分解率的關系Fig.3 The relationship between starch decomposition rate and highland barley β-glucan solutions at different concentrations

這說明高濃度的青稞β-葡聚糖能有效延緩或抑制淀粉被微生物分解利用。此外，隨發酵時間延長，淀粉分解率逐漸增加。在高濃度β-葡聚糖存在的條件下(0.04和0.05 mg/mL)，發酵前期(12～36 h)淀粉水解率增加幅度明顯大于發酵后期(36～72 h)，可能是因為β-葡聚糖在發酵初期大量包裹淀粉阻礙淀粉水解[5,28]，因而淀粉水解率低，但隨著包裹淀粉的β-葡聚糖被酒曲分解的水解酶水解，暴露淀粉量增多，淀粉水解率大幅提高，在發酵后期酒曲中酶量與所需水解的淀粉量間逐步達到供應平衡，因而水解率增幅放緩。由圖3可知，在低濃度的β-葡聚糖存在時淀粉的分解情況與未添加β-葡聚糖組淀粉的分解趨勢相似，但是β-葡聚糖濃度越高淀粉分解率越低。這也進一步說明了β-葡聚糖可能會延緩或抑制淀粉分解且其抑制效果與濃度有關。

2.5.2 不同濃度青稞β-葡聚糖對還原糖影響

由圖4可知，添加β-葡聚糖的試驗中還原糖含量呈先增(12～24 h)后減(24～60 h)再緩增(60～72 h)的趨勢；空白組還原糖含量呈先增(12～24 h)后減(24～36 h)再緩增(36～72 h)。

圖4 不同質量濃度青稞β-葡聚糖與還原糖含量的關系Fig.4 The relationship between reducing sugar content and highland barley β-glucan solutions at different concentrations

從空白組和試驗組還原糖含量變化的時間可以看出，試驗組整體較空白組明顯延遲，并且在同一發酵時間下，青稞β-葡聚糖濃度越高的試驗組，生成還原糖含量越低。此外，在0～12 h，酒醅中微生物開始生長并分泌出大量糖化酶分解淀粉產糖以滿足酒曲中微生物繁殖需要，因此12 h時檢測到還原糖存在；在12～24 h糖化過程占主導，曲霉繼續大量分泌糖化酶使淀粉繼續被分解，從而表現出還原糖含量在12～24 h持續升高；在24～60 h發酵過程占主導，此時由于發酵底物中淀粉減少，曲霉等微生物代謝減弱且酵母菌完成增殖后開始大量利用葡萄糖等可發酵糖產酒，從而表現出還原糖含量在24～60 h持續減少；在60～72 h，由于可發酵糖類已大量被轉化為酒精，因此酵母菌等代謝活動減弱，而曲霉等繼續糖化底物中殘留的淀粉，從而表現出還原糖含量在60～72 h緩慢增加。該過程充分展示了一邊糖化一邊發酵的“雙邊”工藝。

2.5.3 不同濃度青稞β-葡聚糖對酒精度影響

由圖5可知，酒精含量隨β-葡聚糖濃度的增加而降低；在同一發酵時間下，β-葡聚糖濃度越高，淀粉發酵產生的酒精越少。這可能是隨β-葡聚糖濃度的增加，阻礙了微生物分解利用淀粉，從而延緩或抑制淀粉發酵生成酒精。此外，菌種發酵時間會直接影響著乙醇產率，酒精度在12～48 h呈逐漸上升趨勢，在48 h時酒精度達到最高，之后48～72 h酒精度呈逐漸下降趨勢。這可能是在發酵初期(12～48 h)曲霉糖化酶分解淀粉產糖后不斷被酵母菌在厭氧條件下發酵為酒精，在發酵后期(48～72 h)由于糖分減少，酵母可能開始利用發酵產物—酒精作為碳源來維持自身的生長和繁殖，從而使酒精度降低[29]。

圖5 不同濃度青稞β-葡聚糖與酒精度的關系Fig.5 The relationship between ethanol content and highland barley β-glucan solutions at different concentrations

2.5.4 發酵過程中青稞β-葡聚糖含量變化情況

由圖6可知，β-葡聚糖含量均隨發酵時間延長而逐漸降低，且β-葡聚糖含量的減少趨勢呈現先急后緩的特點。

圖6 發酵過程中青稞β-葡聚糖含量變化情況Fig.6 Change of highland barley β-glucan content during the fermentation period

如β-葡聚糖質量濃度為0.05 g/mL的試驗組，β-葡聚糖在12～24 h減少迅速，24～60 h逐漸減少，60～72 h減少趨緩。這可能是因為β-葡聚糖濃度越高越易形成凝膠并包裹在淀粉顆粒表面[5,28]，從而阻礙酒曲中微生物分解利用底物中的淀粉，致使微生物在發酵過程中首先分解利用包裹在淀粉顆粒表面的β-葡聚糖；當包裹在淀粉顆粒表面的β-葡聚糖被大量消耗利用后，淀粉顆粒“暴露”出來，酒曲中微生物又會大量分解利用淀粉，從而減緩了對β-葡聚糖的分解。

為探究酒曲中微生物對青稞β-葡聚糖的利用情況，在不添加淀粉僅添加β-葡聚糖和酒曲的情況下，模擬傳統青稞酒發酵過程，對發酵過程中β-葡聚糖含量進行實時監測。由圖7可知，隨發酵時間延長，β-葡聚糖含量均顯著降低(P<0.05)，下降幅度遠高于有淀粉的發酵(對比圖6)，說明酒曲中的微生物對β-葡聚糖利用能力強，但當有淀粉水解糖作為碳源時，可減緩酒曲微生物對β-葡聚糖的利用。因此，在青稞酒實際發酵過程中應控制發酵時間，減少功效成分β-葡聚糖被過度降解。

圖7 酒曲中微生物對青稞β-葡聚糖利用情況Fig.7 Utilization of highland barley β-glucan by microorganisms in yeast

2.6 青稞β-葡聚糖和淀粉混合物的顯微鏡觀察

為進一步研究β-葡聚糖與淀粉的相互作用，利用光學顯微鏡觀察純青稞淀粉以及β-葡聚糖和青稞淀粉的混合發酵物(如圖8)。

A-純青稞淀粉顆粒; B～F-發酵過程中青稞β-葡聚糖和青稞淀粉混合物; A～D-放大倍數為目鏡×40; E和F-放大倍數為目鏡×10圖8 青稞β-葡聚糖和青稞淀粉光學顯微鏡觀察圖Fig.8 Optical micrographs of highland barley β-glucan and starch

由圖8-A可知，純青稞淀粉呈現清晰完整的大分子顆粒形態。圖8-B～圖8-F)是青稞β-葡聚糖和青稞淀粉混合發酵物的顯微鏡圖，可以看出淀粉顆粒變得模糊且周圍被呈凝膠塊狀的β-葡聚糖包裹覆蓋，當淀粉顆粒大面積被β-葡聚糖包裹附著后會凝聚成團。這說明高濃度的青稞β-葡聚糖易形成凝膠并包裹淀粉使其凝集成團，這與FUMNAMI等[28]的研究一致。結合前面不同濃度β-葡聚糖對淀粉發酵的影響，可進一步說明β-葡聚糖對淀粉分解的抑制作用是由于β-葡聚糖對淀粉的包裹作用，淀粉與酶類接觸的可能性降低，從而降低淀粉的發酵效率。

3 結論

在傳統青稞酒的釀造過程中，淀粉被水解利用，酒糟中的蛋白質、粗纖維、總糖、β-葡聚糖和氨基酸含量增加，且青稞酒糟的氨基酸總量(16 570.08 mg/100 g)遠高于青稞的氨基酸總量(7 671.55 mg/100 g)。此外，隨發酵時間延長，酒醅中總糖含量先增后減，β-葡聚糖含量逐漸下降，酒精度逐漸上升；在模擬釀造工藝中，淀粉分解率、還原糖生成量、酒精產量隨β-葡聚糖濃度的升高而顯著降低(P<0.05)；顯微鏡結果表明β-葡聚糖對淀粉顆粒有包裹作用，可能阻礙了糖化酶與淀粉顆粒的接觸，從而降低了青稞淀粉的發酵效率和產酒量。以上研究結果表明，β-葡聚糖能延緩或抑制淀粉乙醇發酵，且β-葡聚糖濃度越高抑制效果越明顯。

研究還發現，傳統發酵青稞酒的酒糟富集了蛋白質、β-葡聚糖、膳食纖維，可作為一種高營養價值的食品加工副產物，進一步深加工為高附加值產品。但酒曲中的微生物也能有效分解利用β-葡聚糖，因此，需要適度控制青稞酒發酵時間，減少β-葡聚糖損耗。