辣椒籽抗菌肽的安全性評價及其在玉米防霉中的應用

韓玉竹，趙建軍，陳強，吳長鳳，熊偉亮，楊葉梅,2*

1(西南大學 動物科學學院，重慶，402460)2(重慶市畜牧科學院，重慶，402460)

辣椒是全世界范圍內的一種普遍使用的調味品。其副產物辣椒籽占其干果含量的30%～60%，目前我國關于辣椒籽的利用僅集中在辣椒籽油脂研究和抗氧化等方面[1]。有研究報道辣椒籽的主要營養成分包含膳食纖維、脂肪和蛋白質，且其包含9種必須氨基酸，說明其具備較高的開發利用價值[2]。截至目前為止，雖無關于辣椒籽蛋白中存在有毒蛋白的報道，但是關于從中提取的抗菌肽是否含毒以及累計食用后會不會影響食用者的健康問題尚無相關報道。

玉米是世界三大糧食作物之一，其產量僅次于小麥和大米。據有關報道預測到2025年發展中國家對玉米的需求將增加1倍，玉米也將成為全球范圍內產量最大的作物[3]。在我國玉米產量已超過2.16億t，占糧食總產量比重也提升到了35.53%[4]。但玉米和其他糧食作物一樣在儲存期間容易受到霉菌污染。有研究表明，玉米儲存期間如果管理不當造成霉菌繁殖，將會造成50%～80%的損失[5]。

本研究前期發現辣椒籽抗菌肽對玉米、小麥、飼料貯藏過程中的優勢腐敗真菌(曲霉屬、青霉屬、鐮刀菌屬)具有較強的抑制活性，經純化檢測發現，主要是分子質量在7.8 kDa左右的抗菌肽(PSP 7.8)起作用。因此，本試驗根據《食品安全性毒理學評價程序和方法》對辣椒籽抗菌肽的安全性進行評價。同時，以目前市場上防霉應用效果較好的那他霉素和丙酸鈣為對照，依據《玉米儲存品質判定標準》，從霉菌總數和脂肪酸值2個方面對辣椒籽抗菌肽在玉米貯藏中的應用效果進行研究，為辣椒籽抗菌肽作為添加劑在食品、飼料等行業中的應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

辣椒籽抗菌肽的制備：辣椒籽的提取方法采用試驗室前期優化后的步驟。具體為，辣椒所選品種為貴州燈籠椒，其辣椒籽粉碎后，用無水乙醚浸提過夜，去除粗脂肪。按料液比1∶5.05添加至EDTA緩沖液(10 mmol/L Na2HPO4，15 mmol/L NaH2PO4，100 mmol/L KCl, 1.5% EDTA，pH 5.4)中，4 ℃條件下16.13h。將浸出溶液用8層紗布過濾， 8 000 r/min離心15 min，取上清液按計量81.15%飽和度所需的固體硫酸銨量，研磨粉碎后緩慢加入，均勻攪拌至充分溶解，4 ℃靜止4 h，10 000 r/min離心15 min，沉淀冷凍干燥為辣椒籽抗菌肽粗品。進一步結合透析袋脫鹽、10 kDa超濾管超濾以及葡聚糖凝膠層析對辣椒籽抗菌肽進行分離純化，收集經Tricine-SDS-PAGE檢測分子質量在7.8 kDa左右的目標抗菌肽(PSP 7.8)冷凍干燥備用。

試驗動物：健康的昆明種小白鼠、SD大鼠、基礎飼料及籠底墊料均由西南大學動物科學學院試驗動物中心提供。

血清生化指標試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；那他霉素(純度95%),浙江新銀象生物工程有限公司；丙酸鈣(純度99%)，南通奧凱生物技術開發有限公司；玉米，購于重慶市榮昌區農貿市場。

1.2 小鼠急性毒性試驗

將60只健康昆明種小白鼠隨機分成6組，每組10只(雌雄各半)，預飼3 d后進行正式試驗。灌胃前禁食12 h，按照抗菌肽的濃度分為6個組(1組對照組灌喂等量生理鹽水，2～6組分別按照每kg體重灌喂辣椒籽抗菌肽0.008、0.04、0.2、1、5 g)。灌喂后每天定時飼喂并觀察所有組小鼠的精神狀態和死亡狀況。連續觀察7 d，并記錄小鼠中毒情況、異常反應和死亡數量。試驗結束后解剖，肉眼觀察各種臟器及組織的病理變化，并測定其肝臟、脾臟和腎臟的臟器指數。臟器指數測定按公式(1)進行計算：

(1)

1.3 亞慢性毒性試驗

將40只健康SD大鼠隨機分成2組，每組20只(雌雄各半)，預飼3 d后進行正式試驗。其中一組按照300 mg/kg體重每天定時灌喂無菌生理鹽水溶解的抗菌肽溶液，另一組作對照組，每天同時灌喂等體積無菌生理鹽水，每天定時飼喂并觀察大鼠精神狀態等。試驗持續30 d。

大鼠每天的精神狀態和病理組織檢查、臟器指數、增重和飼料利用率的觀察及測定計算方法均同急性毒性試驗1.2。試驗結束后進行眼靜脈采血，采用TEK-Ⅱ全自動血細胞分析儀測定試驗大鼠的血常規指標，大鼠的血清生化指標按相應的試劑盒說明書步驟進行測定。

1.4 辣椒籽抗菌肽在玉米貯藏中的應用

本試驗設置了6個處理組，每個處理6個平行，每份貯藏玉米1 000 g。那他霉素和丙酸鈣的添加量按添加劑手冊建議添加量添加，辣椒籽抗菌肽添加量根據前期黃曲霉抑菌試驗的最低抑菌濃度添加。具體添加處理為：對照(無添加)，處理1(辣椒籽抗菌肽 0.075 g/kg)，處理2(辣椒籽抗菌肽 0.15 g/kg)，處理3(辣椒籽抗菌肽 0.3 g /kg)，處理4(丙酸鈣2.26 g/kg)， 處理5(那他霉素0.3 g/kg)。玉米初始水分含量調節至15%左右，4 ℃放置24 h，待玉米吸收水分后放置于溫度為28 ℃、濕度為75%的培養箱中貯藏，20 d后進行霉菌總數和脂肪酸含量的檢測。

霉菌總數的測定參照國標GB/T 13092—2006進行[6]。以無菌操作準確稱取樣品25 g 至225 mL滅菌好的無菌水中，于振動器上振蕩30 min，制成1∶10 的稀釋液，再用無菌水進行梯度稀釋，選取適宜的3個梯度，分別吸取1 mL稀釋液于滅好菌的培養皿內，及時將冷卻至50 ℃左右的培養基注入培養皿充分混勻。待瓊脂凝固后，倒置于28 ℃恒溫培養箱中培養72 h后，記錄培養皿內霉菌總數，并按稀釋倍數計算得到每克樣品所含霉菌總數。

玉米中脂肪酸含量的測定參照國標GB/T 15684—2015[7]。貯藏應用效果參照國標《玉米儲存品質判定規則》進行評定[8]。

1.5 數據統計與分析

數據采用Excel 2007 處理并用SPSS 20.0 進行統計和分析。

2 結果與分析

2.1 急性毒性試驗

2.1.1 臨床癥狀

通過每天定時對試驗組和對照組小鼠的精神健康狀態觀察。結果發現，本試驗整個過程中灌服辣椒籽抗菌肽的小鼠和無菌水的小鼠精神狀態和采食情況等無明顯差異。也沒有發現經灌服辣椒籽抗菌肽后小鼠出現明顯的表觀中毒現象。

2.1.2 半數致死量計算

由表1可以看出，在整個試驗期對照組和試驗各組均沒有出現小白鼠的死亡。抗菌肽一次灌胃劑量達5 g/kg動物體重仍未出現死亡現象，按食品添加劑急性毒性分級標準，抗菌肽屬無毒級。因此，該抗菌肽作為添加劑安全使用是可行的。

2.1.3 臟器指數變化

不同劑量辣椒籽抗菌肽處理后對小鼠的臟器指數影響見表1。結果表明灌服辣椒籽抗菌肽組小鼠的肝臟指數、脾臟指數、腎臟指數和對照組相比均差異不顯著(P>0.05)，說明在一次性高劑量灌服抗菌肽對臟器形態及重量均無影響。

2.1.4 臟器及組織病理變化

通過觀察不同組小鼠的臟器及組織(圖1)，結果發現各試驗組無臟器出現變性或壞死的發生，且各試驗組和對照組間臟器的色澤、形態、質地等均沒有差異。由此說明，一次灌服5 g/kg的辣椒籽抗菌肽不會造成臟器和組織的急性病理現象。

表1 小鼠生長體征情況Table 1 The toxicity signs of mice after acute toxicity test

注：料重比表示飼料消耗量與小鼠增重的比值。

圖1 小鼠臟器及組織病理變化Fig.1 The toxicity signs of mice organ after acute toxicity test

2.2 亞慢性毒性試驗

2.2.1 臨床癥狀

根據整個試驗期的觀察，結果發經過30 d累計灌服辣椒籽抗菌肽后試驗組和對照組大鼠的精神狀態等均無明顯差異，也未發現連續灌服抗菌肽的大鼠有表觀中毒現象。說明從表觀癥狀無法確定辣椒籽抗菌肽是否存在毒害作用。

2.2.2 臟器、組織病理變化觀察及臟器指數測定

試驗結束后，解剖暴露兩組試驗大鼠臟器及組織發現同對照組大鼠相比的2組的臟器均未見有明顯的臟器及組織病理變化。分離肝臟、脾臟和兩側腎臟，然后稱重，計算對照組和試驗組的肝臟指數、脾臟指數、腎臟指數，結果見表2。

表2 體重及臟器指標Table 2 Weight and organ indicators

結果發現每天灌服辣椒籽抗菌肽的大鼠和每天灌服等量無菌水的大鼠在臟器指數上均無顯著性差異。

2.2.3 增重及飼料利用率

分別統計試驗組和對照組每10 d的增重、耗料和飼料利用情況。結果見表3。

表3 抗菌肽對大鼠增重及飼料利用率的影響Table 3 Effect of antifungal peptide on weight gain and feed utilization of SD rats

注：料重比表示飼料消耗量與大鼠增重的比值。下同。

結果表明對照組和試驗組之間的飼料消耗、增重和飼料利用率之間均無顯著性差異。

2.2.4 對血液常規指標的影響

連續灌服辣椒籽抗菌肽后對大鼠的血液常規指標的影響結果見表4。與對照組相比灌服抗菌肽大鼠組淋巴細胞數和血小板總數有所升高，但與和對照組相比無顯著性差異(P>0.05)，說明30 d連續灌服0.3 g/kg體重的抗菌肽對大鼠血液指標無顯著影響。

表4 抗菌肽對大鼠血液常規檢查結果的影響Table 4 Effect of antifungal peptide on general inspect of blood of SD rats

2.2.5 對血液生化指標的影響

辣椒籽抗菌肽經30 d連續灌喂后對大鼠血液生化指標的影響結果見表5。試驗組各指標和對照組相比差異不顯著(P>0.05)，但通過數據也能發現試驗組血清中的總蛋白、球蛋白和甘油三酯含量略高于對照組。

表5 抗菌肽對大鼠血液常規檢查結果的影響Table 5 Effect of antifungal peptide on biochemical of blood of SD rats

2.3 辣椒籽抗菌肽對貯藏玉米中的霉菌總數和脂肪酸含量的影響

霉菌總數和脂肪酸值反映了谷類品質裂變程度[9-12]。采用玉米模擬儲藏試驗(種子含水量15%，儲藏溫度28 ℃、儲藏濕度75%)，以目前市場上應用較好的防霉劑(丙酸鈣、那他霉素)為參照，評價不同濃度辣椒籽抗菌肽在玉米儲藏中的效果。玉米儲藏20 d后霉菌和脂肪酸值如圖2所示，處理前玉米種子霉菌總數小于103CFU/g，脂肪酸值為15，說明原料種子品質較好。但隨著儲藏時間的延長，對照組中霉菌大量繁殖，總數大幅增加，20 d時已發生霉變，霉菌數量超過106CFU/g，脂肪酸值升到了56 mg KOH/100 g，并出現肉眼可見的霉變特征，色澤氣味發生變化。與對照相比，添加不同防霉劑均能有效抑制較高水分玉米儲藏過程的霉菌生長，顯著降低脂肪酸值。0.3 g/kg的辣椒籽抗菌肽的防霉效果與丙酸鈣和那他霉素標準添加量無顯著差異(P>0.05)。說明辣椒籽抗菌肽具有開發為新型防霉劑，在農產品安全貯藏中應用的潛力。

對照-無添加；處理1-辣椒籽抗菌肽 0.075 g/kg；處理2-辣椒籽抗菌肽 0.15 g/kg；處理3-辣椒籽抗菌肽 0.3 g/kg；處理4-丙酸鈣2.26 g/kg；處理5-那他霉素0.3 g/kg圖2 不同防霉劑對貯藏玉米霉菌總數(A)和脂肪酸值(B)的影響Fig.2 Effect of different antifungal agents on mold quantity and fatty acid value of corn

3 討論

隨著人們對食品安全的重視，生物抗菌肽的挖掘和應用，越來越受到科學研究者的青睞。但是，任何新發現或研發獲得的新型添加劑的安全問題，不容忽視。在確定其可用于大面積使用之前都必須對其安全性做詳細評定，以保證其應用范圍和使用劑量。關于抗菌肽安全性的報道，目前大都認為具有安全性和有效性[13-14]，其抗菌肽性已應用在酒[15]、海鮮[16]、畜產品[17]保鮮中，其促生長特性已應用在家畜飼養中[18-19]。但是，研究發現，也有部分多肽類物質在應用過程中產生了不良反應[20-22]。因此課題組分別開展了小鼠急性毒性試驗和大鼠亞慢性毒性試驗，對辣椒籽抗菌肽的安全性進行評價。結果顯示小鼠在最大灌喂量為5 g/kg后也無明顯的中毒跡象，依據《食品安全性毒理學評價程序和方法》初步表明其屬于安全無毒級別。大鼠連續30 d灌服劑量為300 mg/kg體重的辣椒籽抗菌肽后，對照組相比試驗組的各項指標均無顯著差異，說明長期連續使用也無慢性毒性作用，安全性好。初步證明辣椒籽抗菌肽是一種無毒物質，其作為農產品防霉劑是安全的。

真菌污染是儲存過程中導致谷類及飼料變質的主要原因，并且真菌產生的毒素會對人和動物造成嚴重的危害[23]。本試驗結果表明，不同濃度辣椒籽抗菌肽處理后和對照組相比均能顯著降低霉菌總數，這與GUPTA研究的植物乳桿菌產生的抗菌肽對谷物試驗室貯藏，以及叢苑研究得芽孢桿菌抗菌肽對玉米實驗室貯藏的結果一致[11-12]。其中0.3 g/kg辣椒籽抗菌肽處理后的霉菌總數與那他霉素試驗組差異不顯著，顯著低于丙酸鈣試驗組，說明辣椒籽抗菌肽具備良好的防霉效果。同時，添加不同濃度抗菌肽都有效的降低了玉米原料中脂肪酸值。國標的谷物儲藏判定規則中，脂肪酸值作為玉米的宜存指標，反映了玉米品質劣變程度[8]。微生物活性與玉米品質指標脂肪酸值有著密切關系，霉菌的代謝分泌的脂肪酶促使脂肪水解造成脂肪酸積累，是造成玉米品質劣變的重要因素[24]。白巖對不同儲藏溫度下高水分玉米微生物活性值與玉米主要品質指標脂肪酸值的變化及其相關性進行了分析，結果表明，微生物活性值與玉米脂肪酸值顯著相關，相關系數為 0.786 7～0.992[24]。本試驗中霉菌數量與脂肪酸值的相關系數為0.933 6，具有極顯著的正相關性(P<0.01)，這說明抗菌肽在降低玉米中霉菌數量的基礎上，進而有效減少玉米原料因微生物引起的酸敗。其中的辣椒籽抗菌肽(0.15 g/kg、0.3 g/kg)與丙酸鈣、那他霉素標準添加量無顯著差異(P>0.05)。辣椒籽抗菌肽可有效抑制霉菌生長，降低脂肪酸值，有望開發為新型防霉劑應用于農產品或飼料貯藏中。

以上結果對辣椒籽抗菌肽的推廣應用提供了一定的參考數據。但關于辣椒籽抗菌肽在機體內的代謝情況仍需要做進一步研究，以期對辣椒籽抗菌肽的安全性進行全方位的評價，為其將來在食品和畜牧等方面的推廣應用提供堅實的理論依據。