小米發(fā)糕發(fā)酵劑中乳酸菌的篩選及其在小米發(fā)糕中的應用

張桂英 朱 靜 張喜文 師俊玲 曲 睿 杜文娟 姜龍波 李 萍

(山西農業(yè)科學院谷子研究所1，長治 046011)

(信陽農林學院食品學院2，信陽 464000)

(空間生物實驗模擬技術國防重點學科實驗室; 西北工業(yè)大學生命學院3，西安 710072)

小米營養(yǎng)豐富，含有蛋白質、礦物質、維生素及鈣磷鐵等人體必需的營養(yǎng)物質[1，2]，具降脂、降壓、滋陰養(yǎng)血、調節(jié)睡眠等功效[3]。目前，米發(fā)糕[4]和小米糕[5]研究較多，但以小米為主要原料的發(fā)糕鮮見報道。小米發(fā)糕風味獨特、極易消化，是一種深受大眾喜愛的粗糧制品。民間生產多采用傳統(tǒng)自然發(fā)酵方法，主要菌種為乳酸菌和酵母菌。由于多數乳酸菌對人體健康的有益特性及其在國民經濟中的重要作用，近年來，利用乳酸菌發(fā)酵食品、藥品等層出不窮[4]。如何將小米發(fā)糕發(fā)酵劑中的優(yōu)良乳酸菌引入市售混合菌劑，將會成為傳統(tǒng)發(fā)酵劑研究領域的一個創(chuàng)新點[4,6,7]。

米發(fā)糕發(fā)酵劑中優(yōu)勢菌是酵母菌和乳酸菌。乳酸菌屬包括肉食桿菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬、酒球菌屬、片球菌屬、鏈球菌屬、四鏈球菌屬、魏斯氏菌屬[8]。本研究在山西省農業(yè)科學院谷子研究所已有的工作基礎上[9-11]，從前期選育的優(yōu)良小米品種中，通過小米發(fā)糕感官評價、理化分析和質構分析等篩選獲得5份品質差異較大的小米品種為對象，利用自然發(fā)酵法制備發(fā)酵劑，通過細菌總數測定和其制備小米發(fā)糕品質的感官評價，初步篩選差異較大的2個品種進行乳酸菌的分離。采用乳酸菌傳統(tǒng)分離方法，分析了發(fā)酵劑中的乳酸菌優(yōu)勢菌群，并通過分離乳酸菌制作小米發(fā)糕，測定其對產品風味、品質等的影響，進一步篩選適合小米發(fā)糕制作的乳酸菌菌種。為進一步了解傳統(tǒng)發(fā)酵劑中乳酸菌的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1原料

發(fā)酵劑制備用小米粉：1號[(長農35，國鑒谷2013002)[9]，2號(晉谷56，晉審谷(認)2013002)][10]，6號(長谷4號，國00027992)[11]，8號(M1)，10號(K4)，由山西農業(yè)科學院谷子研究選育；乳酸菌對小米發(fā)糕品質影響實驗用小米粉：“谷谷香”小米面粉；味憶佳綿白糖；新良中勁小麥粉；安琪高活性干酵母。

1.1.2小米粉的制備

小米經除雜后，40℃干燥至恒重后進行磨粉，小米粉過100目篩備用。

1.1.3培養(yǎng)基及主要藥品試劑

MRS固體(液體)培養(yǎng)基[4]；TaqDNA聚合酶、D2000Marker；細菌基因組DNA提取試劑盒；其他化學藥品均為進口分析純藥品。

1.1.4儀器與設備

T100TMThermal Cycler PCR儀；SW-CJ-2F 超凈化工作臺；LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌器；SPX-250生化培養(yǎng)箱；TGL-16C離心機；JC101-2A電熱干燥箱；XF-2醒發(fā)箱；SH2-82A氣流恒溫振蕩器；TU-1810紫外可見風光光度計。

1.2 方法

1.2.1小米發(fā)糕蒸制工藝

參照米發(fā)糕的制備工藝進行調整[12, 13]，稱取120g小米面粉，加入6g綿白糖之后攪拌均勻，用120mL沸水燙面，然后加入80g中筋面粉，用手和面至光滑，至35℃醒發(fā)箱發(fā)酵2h，然后觀察生面團的形態(tài)和發(fā)酵速度。取發(fā)酵面團每50g塑性，然后進行30min二次醒發(fā)，涼水上鍋，電磁爐1300W到鍋蓋發(fā)熱，調制1600W到出汽，再蒸制30min。

1.2.2小米發(fā)糕發(fā)酵劑中乳酸菌的分離、純化及篩選

從酵子內部及酵子表面各取面5g，合并轉置于90mL 無菌水的三角瓶中(瓶中預先放一定數量的小玻璃珠)，160r/min，30min，使酵子樣品盡可能溶解，制成酵子懸液。將酵子懸液依次稀釋103～106倍，制成梯度稀釋液，混勻后37℃培養(yǎng)48h，挑取不同形態(tài)單個菌落，劃線接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，重復4次純化乳酸菌。純化得到的乳酸菌菌株，觀察并記錄菌落特征并挑取單菌落轉接到斜面培養(yǎng)基上，并置于4℃保藏。小米發(fā)糕發(fā)酵劑中乳酸菌屬的鑒定按照文獻[14,15]中的方法進行，包括：革蘭氏染色；過氧化氫酶實驗；葡萄糖產氣、產酸實驗。

1.2.3乳酸菌對小米發(fā)糕品質的影響

(1)乳酸菌的擴大培養(yǎng)：將1.2.2斜面保存的乳酸菌，接種于裝有5mLMRS培養(yǎng)基試管中，37℃培養(yǎng)24h，按5%的接種量再接種于100mL三角瓶中，培養(yǎng)結束后，5000r/min離心10min收集菌體，用滅菌蒸餾水清洗3次，4℃保存用于小米發(fā)糕制作。

(2)小米發(fā)糕制作：按1.2.1方法制備小米發(fā)糕，酵母菌與乳酸菌的菌種比例107∶107(數量比)，加入量2%。

(3)指標測定:小米發(fā)糕含水量的測定[16]，比容采用菜籽置換法[17]，pH和總酸度(TTA值)測定參照GB5009.239—2016；還原糖含量測定參照GB5009.7—2016。

(4)感官評定:參考文獻進行相應調整[13]，制定小米發(fā)糕感官評價標準，見表1。小米發(fā)糕感官評價方法：在小米發(fā)糕蒸制好后2～5h進行感官評定。10位經過訓練的評委對切好的1.0cm厚小米發(fā)糕樣品進行評分。評委中的男性4位，女性6位，年齡在18～35歲范圍內。小米發(fā)糕的感官評定主要從小米發(fā)糕的食用品質指標進行評分(表1)，取其平均值。以小米發(fā)糕形態(tài)蓬松、色澤金黃均勻、有柔和的發(fā)酵味、酸甜適中，口感松軟為最高分(滿分100分)，總分為各項指標平均得分之和。

表1 小米發(fā)糕感官評價標準表

其中，小米發(fā)糕體積的測定采用小米置換法[17]。比容(mL/g)= 體積(mL)/質量(g)，取4次測定的平均值作為米發(fā)糕的比容。

1.2.4菌株16s rDNA序列分析

采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，使用1%瓊脂糖電泳進行檢測，并以此DNA為模板，利用細菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGHTACCTTGTTACGACTT-3’)針對性地對16s rDNA序列進行擴增。PCR反應體系為50μL：10×Buffer5μL、dNTP4μL、MgCl24μL、引物(10μmol/L)各1μL、模板DNA40～50ng、Ex Taq1.5U、滅菌超純水補齊至50μL。反應條件為：98℃2min，98℃10s，57℃10s，72℃15s，35個循環(huán)，72℃2min。PCR擴增產物用1%的瓊脂糖進行檢測。純化后的PCR產物用ABI3730基因測序儀測序。使用Lasergene軟件內部的SeqMan對測序結果進行拼接及引物序列校準。將拼接后的序列提交到NCBI數據庫進行BLAST比對，然后使用MEGA5軟件對基因序列及若干近源種的16s rDNA基因進行多序列比對，并使用鄰接法進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌分離源篩選

將在30℃下培養(yǎng)48h的菌落進行計數，并結合小米發(fā)糕相應的品質特征，篩選差異較大的兩種分離源，結果見表2。

表2 發(fā)酵劑中乳酸菌總數和小米發(fā)糕的品質特征

從菌落計數結果看，乳酸菌菌落數達到107～109cfu/g，與大多數酸面團的報道結果一致[18,19]。

對采集的小米粉制備的小米發(fā)糕樣品感官進行評定，由表2可知，6號小米粉制備的小米發(fā)糕酸度最大，黏性較大，質硬，彈性較低；2號和10號樣品酸味淡，黏度略大，總體彈性低，總體來說，10號比2號品質好，但酸味比2號濃些；8號樣品酸味較大，黏度略大，彈性較好；1號樣品發(fā)糕酸味適中，質地細膩，彈性較好，口感更順滑柔和。且發(fā)現(xiàn)6號面團的發(fā)酵速度較其他快，說明同樣時間內，其產酸量更大，其他產品發(fā)酵速度差異不大。

總體來說，1號樣品感官品質較好，6號較差，且面團的發(fā)酵速度也不同。不同來源的酸面團中細菌的種類和數量均有所不同[20]，因此選擇差異最大的2個發(fā)酵劑作為乳酸菌的分離源。

2.2 乳酸菌的篩選

將分離純化的91株細菌，進行革蘭氏染色、葡萄糖產酸產氣和過氧化氫酶活性檢測，由乳酸菌的特性，認為革蘭氏染色陽性，葡萄糖產酸陽性，葡萄糖產氣陰性及過氧化氫酶陰性的菌株為乳酸菌。符合條件的菌株共有33株，初步鑒定為乳酸菌。

2.3 乳酸菌對小米發(fā)糕品質的影響

2.3.1乳酸菌對小米發(fā)糕含水量的影響

調粉后，含水量高的面團容易被CO2膨脹，因而發(fā)酵速度較快，較硬的面團則對氣體膨脹力的抵抗能力強，從而使面團發(fā)酵速度受到抑制[21]。由圖1可知，編號為LA1-46、LA1-28、LA6-34和LA6-40的乳酸菌調制的面團含水量較高(>44%)，發(fā)酵速度較快。根據GB7099—2015《糕點、面包衛(wèi)生標準》、GB/T20977—2007《糕點通則》以及GB5009.3—2016《食品中水分的測定》等的要求，小米發(fā)糕的含水量應該在34%～44%之間。含水量的多少，影響著小米發(fā)糕的口感，含水量太低的話，嚼起來比較干澀。由圖1可知，LA1-28和LA6-34乳酸菌蒸制的小米含水量均大于44%，不符合標準，其余的小米發(fā)糕均符合要求，與面團含水量結果一致。但相對來說LA1-46、LA6-35和LA6-40乳酸菌蒸制的小米發(fā)糕含水量適中，口感較好。

圖1 小米發(fā)糕面團(a)和發(fā)糕含水量(b)

圖2 小米發(fā)糕pH值(a)和總酸度(TTA值)(b)

2.3.2乳酸菌對小米發(fā)糕pH值和總酸度(TTA值)的影響

小米發(fā)糕樣品的酸度測定結果見圖2。所有樣品的pH值處于4.92～6.26之間，TTA值4.9～10.1，國內外鮮有小米發(fā)糕相關報道，與國內外已報道的面制品的酸度基本一致[18]。其中，LA6-29乳酸菌對小米發(fā)糕面團pH值與TTA值與其他樣品相差較大，pH最大，TTA值較低。總酸度(TTA值)的測定可以發(fā)現(xiàn)，LA6-39乳酸菌發(fā)酵下的小米發(fā)糕pH值最小，產酸最多，發(fā)酵效果最好。LA1-24乳酸菌發(fā)酵下的小米發(fā)糕pH值最大，產酸最少，發(fā)酵效果最差。乳酸菌除了主要產生乳酸外，還能促使形成多種新的香味物質。但是，如果pH過低也會影響風味和口感。參照GB/T21118—2007，總酸度要求5.6～7.2，LA1-46、LA6-10、LA6-16和LA1-28乳酸菌蒸制的發(fā)糕均不符合國際標準。因此，結合小米發(fā)糕的感官品質和水分含量結果，LA6-35和LA6-40乳酸菌蒸制的小米發(fā)糕風味更好。乳酸菌在發(fā)酵過程中，能產生乳酸、醋酸等，降低發(fā)酵制品中pH值，并能合成具有抗菌作用的細菌素，這對于抑制發(fā)酵食品中致病、致腐菌具有重要意義[22]。

2.3.3乳酸菌對小米發(fā)糕糖含量的影響

不同乳酸菌發(fā)酵的樣品，可溶性糖含量的變化也存在差異，由圖3可知，LA6-40乳酸菌發(fā)酵的小米發(fā)糕還原糖含量最高，LA6-28乳酸菌發(fā)酵的小米發(fā)糕還原糖含量最低。單一乳酸菌發(fā)酵的老面團的樣品各可溶性糖含量最高，乳酸菌和酵母菌復配使用次之[23]，乳酸菌可調節(jié)面制品的可溶性糖含量，LA6-40乳酸菌對小米發(fā)糕還原糖含量影響最大。糖類在小米發(fā)糕最終的口感方面影響很大，如果糖度過低，其酸味就過高，所以，結合小米發(fā)糕的感官品質和其他結果，LA6-40乳酸菌發(fā)酵的小米發(fā)糕酸甜適中，風味最好。

圖3 小米發(fā)糕還原糖含量

表3 乳酸菌發(fā)酵下的小米發(fā)糕感官評定

2.3.4乳酸菌對小米發(fā)糕感官品質的影響

GB/T20977—2007《糕點通則》中對小米發(fā)糕的感官指標要求是以小米發(fā)糕形態(tài)蓬松、色澤金黃均勻、有酒香味、有柔和的發(fā)酵味、口感松軟、酸甜適中、無粘牙現(xiàn)象、切面有細密針眼且分布均勻、加壓后能恢復現(xiàn)狀為最高分(滿分100分)。由表3可知，經過感官評定發(fā)現(xiàn)，LA6-40和LA1-18乳酸菌發(fā)酵下的小米發(fā)糕總分較高，適宜作為發(fā)酵小米發(fā)糕復配的乳酸菌，與已有報道結果相同，非小麥粉制品由于面筋蛋白含量較少，在預防腹腔疾病方面具有積極作用，但不宜通過酵母菌發(fā)酵，而乳酸菌可很好的解決此問題。例：乳酸桿菌比酵母菌降pH能力更強，短乳桿菌可生成更多的雙乙酰，而腸膜樣明串株菌可賦予玉米粉高黏度特性，同時這3種菌株制作的玉米面包具有極佳的感官特性[24]。乳酸菌對小米發(fā)糕品質的改良的原因可能是其在發(fā)酵中產生的蛋白酶可在酸性環(huán)境下降解谷蛋白，這種降解可改善面團流變學特性，使面包獲得更好的質地[25]；其不僅可產生乳酸，還能生成乙酸、丙酸等其他有機酸，與發(fā)酵中生成的醇、酮等作用，生成具有獨特風味的其他物質[26]；起到一定的自然防腐效果[27]。Katina等[28]研究發(fā)現(xiàn)，采用乳酸菌發(fā)酵全谷物面團，不僅能改善面團營養(yǎng)價值，且可為相關保健制品的研發(fā)提供參考。

2.4 乳酸菌的系統(tǒng)鑒定

乳酸菌在改良MRS平板上的菌落形態(tài)為：直徑約1～3mm、圓形、中間突起、邊緣整齊、表面光滑濕潤、乳白色、菌體黏稠；革蘭氏染色鏡檢為G+短桿菌，短鏈或成鏈或成鏈排列。

以乳酸菌的總DNA為模板，采用細菌16s rDNA通過引物進行擴增，得到單一條帶，大小約為1.5kb的特異性擴增產物。并將PCR產物送公司進行序列測定，具有典型的16s rDNA。由圖3可知，測序菌株與比對菌株以非常高的置信度處于同一分支上，因此可判定，通過BLAST軟件在Genbank中進行序列相似性比對，菌株與相關近緣模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。由系統(tǒng)發(fā)育分析判斷，11株菌株歸屬為食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria)(LA1-10、LA1-12、LA1-18、LA1-27、LA1-38、LA6-3、LA6-10、LA6-12、LA6-29、LA6-35、LA6-40)，LA6-8歸屬為融合魏斯氏菌(Weissellaconfusa)，LA6-39歸屬為明串珠菌屬(Leuconostoc)，LA1-24歸屬為檸檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)，LA6-16歸屬為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，LA1-28歸屬為腸桿菌屬(Enterobacter)，LA1-15、LA1-29、LA1-46和LA6-4經過多次建樹和其他類別親緣關系較遠。

注：采用鄰接(Neighbor-Joining)法和p距離公式進行系統(tǒng)發(fā)育分析，括號內為GenBank收錄號，每個分支點處的數字為Bootstrap(1 000次抽樣)的支持百分率，標尺代表0.1%的序列差異度。

酸面團中分離出乳酸菌50多種，絕大多數是乳桿菌如短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria)、融合魏斯氏菌(Weissellaconfusa)等，與報道一致[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，LA6-40制備小米發(fā)糕的綜合感官評價最高，經鑒定為食竇魏斯氏菌。其對產品品質改良的主要原因可能是食竇魏斯氏菌產生的胞外多糖可改善蕎麥酸面團糖代謝、面包面團面筋網絡結構及面包烘焙特性[30]，融合魏斯氏菌也具備同樣的作用。植物乳桿菌也用于改善糙米糕等產品品質和風味[31]。

3 結論

采用山西地區(qū)五種小米粉樣品制備小米發(fā)糕發(fā)酵劑，其中8號(M1)發(fā)酵劑中乳酸菌數最少，6號(長谷4號)乳酸菌數最多。感官評定結果表明，6號小米粉制備的小米發(fā)糕酸度最大，黏性較大，質硬，彈性較低，品質最差；1號樣品發(fā)糕酸味適中，質地細膩，彈性較好，口感更順滑柔和，品質最好。選擇品質差異最大的6號和1號發(fā)酵劑作為后續(xù)乳酸菌分離源。共分離乳酸菌91株，革蘭氏染色陽性，葡萄糖產酸陽性，葡萄糖產氣陰性及過氧化氫酶陰性的菌株33株。經分子鑒定發(fā)現(xiàn)，食竇魏斯氏菌(11株)、魏斯氏菌屬(18株)和檸檬明串珠菌(4株)，其中優(yōu)勢菌為魏斯氏菌屬。乳酸菌對小米發(fā)糕品質影響的研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌1-6-40發(fā)酵制備的小米發(fā)糕含水量39.74%，pH6.20，TTA值5.3，還原糖含量2.27g/100g，其感官評分77.1分，其色澤金黃，口感細膩，酸甜適中，咬勁適度，彈性良好。