紙基薄層快速凈化策略及辣椒油中痕量殘留檢測方法研究

何連軍 李詩言 賴姝毓 張宜明 龐林江 戴 丹

(杭州職業技術學院1，杭州 310018)

(浙江水產技術推廣總站2，杭州 311300)

(浙江農林大學農業與食品科學學院3，杭州 311300)

(浙江農林大學信息工程學院4，杭州 311300)

基質是樣品中被分析物以外的物質，對分析物的分析過程有著顯著的干擾，并影響分析結果的準確性。近年，針對復雜基質的樣品制備和凈化技術獲得了飛速發展并廣泛地應用于食品安全、化學和環境分析領域。固相萃取(Solid phase extraction,SPE)、凝膠色譜(Gel polymer chromatography,GPC)以及快速固相分散萃取(QuEChERS)等新技術在食品安全分析中得到了廣泛的應用[1-7]。

糧油食品加工過程中可能涉及到一些非法添加劑加入[8]，如辣椒油中可能會違規添加蘇丹紅等非人工合成染料色素。一般認為蘇丹紅I 的濃度在100～1000mg/kg之間才能賦予相應食品應有的顏色[3]。蘇丹紅I的log P值大約在5.86，這意味著其有著非常高的脂溶性[4]。針對諸如油脂類復雜基質樣品，目前國標法檢測樣品前處理步驟包括旋轉蒸發、氧化鋁柱層析富集、氮吹濃縮等，但其操作復雜，涉及設備和轉移步驟多，溶劑消耗大，流程長易造成組分損失和污染。因此，開發新的快速凈化策略并同時達到節約溶劑、環境友好的效果有著科學與實踐意義。

薄層色譜(Thin laye chromatography, TLC)作為一種傳統的分離方法，在樣品分析或制備中獲得廣泛應用[9]。然而，現有薄層色譜法存在上樣量不足、分析方法靈敏度不足等某些缺點。隨著液相色譜-質譜方法的普及，儀器分析的靈敏度獲得較大提升從而彌補了薄層層析的樣品通量不足缺點[10]。本研究選擇蘇丹紅作為油脂類樣品食品污染物的模擬底物[11,12]，采用柔性紙基薄層色譜條帶建立紙基薄層凈化策略，探索紙基薄層凈化條帶在凈化策略的可行性，凈化后的辣椒油樣品通過液相色譜或串聯質譜等設備能靈敏地檢測這些化合物，整個過程快速、簡便、節省溶劑。本研究針對基質復雜的油脂樣品提供了一種凈化和痕量殘留的檢測策略，并有望應用于其他食品安全分析領域。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硅膠G60作為薄層條帶固定相(200～400目)，亮藍、檸檬黃、日落黃、蘇丹紅染料標準溶液、聚氯乙烯(PVC)涂布紙；對照固相萃取小柱采用蘇丹紅專用小柱(ProElut SDH，500mg，6mL，Partnumber：65909)；樣品為低油脂含量樣品為辣椒粉樣品(辣椒油的主要原料之一)，高油脂樣品為辣椒油樣品。

1.2 儀器與設備

SP-Ⅱ電動點樣機，玻璃展開缸(100cm×200cm)，真空抽濾裝置，分析天平，均質器，其他輔助儀器包括氮氣吹掃器、IKA均質、振動、水浴聲波發生器；旋轉器蒸發工具，恒溫水浴鍋；采用12通道手動固相萃取裝置；液相色譜-質譜聯用及相關色譜柱；分析儀器主要包括ExionLC AD系列液相色譜儀、4500Qtrap三重四級桿質譜儀。

1.3 紙箔薄層色譜板的制備

聚乙烯(PC)涂布紙(A4打印紙尺寸)被用作薄層基材。首先取適量硅膠G60、黏合劑羧甲基纖維素與水混合成為待涂覆固定相，用鐵尺刷在涂布紙表面，然后在85℃的烘箱中干燥30min，儲存在干燥器中待使用。紙基薄層色譜條帶的制備細節可參見之前的工作[13]，可根據試樣含油脂量的不同類型，可在紙箔背板上用鉛筆標記出特征靶區標記。

1.4 油脂類樣品的制備與凈化

1.4.1固相萃取凈化

固相萃取凈化是當前實驗室常用的凈化手段，針對本研究底物油脂中的蘇丹紅，固相萃取方案參考采用了目前技術上成熟的迪馬科技ProElut SDH固相萃取柱和相關處理程序，并作為TLC凈化的常規對照方法。首先稱取0.5g辣椒油樣品(加標樣品在樣品中加入不同濃度蘇丹紅標準溶液)，以10mL乙腈均質攪拌5min，超聲提取5min，8000r/min下離心2min，將下層殘留物依次用10mL、10mL乙腈按照之前步驟重復提取兩次，合并三次上清液。將上清液在40℃水浴條件下減壓蒸至近干，再加入5mL正己烷混勻，待凈化。辣椒油的主要原料辣椒粉樣品則提取過程同前，稱量0.5g辣椒粉樣品以乙腈提取，最終以5mL正己烷混勻，待凈化。

固相萃取凈化：5mL正己烷活化柱子后，加入待凈化液，棄去流出液。依次加入5mL正己烷，5mL1%乙酸乙酯正己烷，棄去流出液后再加入10mL30%乙酸乙酯正己烷，收集流出液，將洗脫液在40℃下減壓蒸餾近干，溶液以乙腈定容1.0mL，供HPLC-MS分析。

1.4.2TLC凈化

稱取0.5g辣椒油樣品，直接用2.0mL正己烷直接稀釋0.5g油脂樣品，無需乙腈提取步驟。辣椒粉樣品則需要與前述提取定容步驟一致，配置成待凈化溶液。準確移取50μL樣品稀釋待凈化溶液精確地抽吸到薄層色譜點樣器上(加熱板溫度為50攝氏度)。以條帶上樣模式將樣品自動打印在凈化條帶(30mm×60mm)的上樣區線上，然后將制備好的條帶插入展開缸，以正己烷/丙酮/冰乙酸(65∶35∶1)為展開劑進行薄層色譜展開凈化。當展開劑的前沿到達該線時，該過程結束，然后取出在平板上干燥。將蘇丹紅展開目標區約0.5cm寬，整體裁切下轉移至細管玻璃試管，加1mL乙腈超聲提取2次，合并提取溶液，氮吹至近干，以0.2mL氨化乙腈(2%)復溶后高速離心，上清液轉移至內插管的進樣瓶中待進樣。

1.5 LC-MS/MS分析條件

色譜柱為Phenomenex Kinetex C18(2.1mm×100mm，2.6μm)；流動相A為乙腈，流動相B為5mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)；柱溫為40℃；流速為0.4mL/min；進樣量為2μL。梯度洗脫程序：0～0.5min，60% B；0.5～5.0min，60%～5% B；5.0～7.0min，5% B；7.0～7.1min，5%～60% B；7.1～10min，60% B。離子源為電噴霧離子源，正源模式，離子源溫度550℃，電噴霧電壓5500V，霧化氣(GS1)壓力345kPa，輔助氣(GS2)壓力379kPa，氣簾氣(CUR)壓力172kPa，掃描方式為多反應監測(MRM)模式，具體質譜參數見表1。

表1 目標物化合物的質譜參數

注：* 表示定量離子。

1.6 靈敏度、線性范圍以及準確性回收率實驗

以空白裁切條帶作為基質補償溶液，配制工作曲線和標準溶劑配制的曲線進行對比，確定靈敏度、線性范圍。本研究分別在2、10、200μg/kg的加標水平上對辣椒油樣品中的加標樣品進行了回收率研究。LC-MS在MRM定量模式下進行用回收實驗保證分析結果的準確性。

2 結果與討論

2.1 紙基薄層條帶分離活性的表征

紙基薄層條帶在使用之前，需對其分離活性進行表征考查。以STAHL法作為測定薄層條帶分離活性的參考方法[14]。采用檸檬黃、亮藍和日落黃3種染料來指示當前條帶的分離活性。從圖1中可以觀察到3種染料組分的Rf保持恒定，且3種染料化合物被完全分離，說明現有的紙基薄層條帶可以有效地分離指示化合物，因此，本試驗結果驗證了現有的薄層條帶保持了高分離活性。

注：a-d依次為亮藍，日落黃，檸檬黃及其3種混標，5 mg/mL。

2.2 展開溶劑的選擇優化

為了消除干擾和基質化合物，將蘇丹紅4種組分集中收集到目標區，需要選擇不同的有機溶劑及配比。由于蘇丹紅自身顏色，在平面色譜中凈化和分離的結果肉眼可見，故展開效果很直觀。選擇比較了正己烷/乙醚(6∶1)、正己烷/丙酮(65∶35)、氯仿/丙酮(9∶1)等體系，結果表明，正己烷/乙醚(6∶1)體系能有效分離辣椒油提取過程中出現的蘇丹紅等色素及干擾，但這4種蘇丹紅化合物分別位于2個不同的Rf位置導致四組分不能集中流出，從而不適合下一步同時裁切4種目標化合物。氯仿/丙酮體系不能有效分離目標化合物和其他干擾。正己烷/丙酮(65∶35)體系提供了較好的分離效果，4種蘇丹紅化合物集中位于同一位置，比移值約在0.75處，且四組分流出集中，展寬約0.2～0.5mm，有利于下一步裁切。該比移值與王群等[15]的研究結果一致。鑒于乙酸可以有效地降低目標化合物的拖尾效應[16]，在現有的溶劑體系中加入一定量的乙酸，最終優化選擇正己烷/丙酮/乙酸(65∶35∶1)體系作為最終優化的展開體系。

2.3 樣品的凈化制備

固相萃取法是樣品制備與凈化可靠的方法，但其固相萃取柱的成本和一定的有機溶劑消耗是不可避免的。近年來，快速、低有機溶劑消耗的前處理成為發展新型樣品前處理技術的一個主要趨勢。一些研究者開始使用自動薄層色譜制備儀器對復雜的樣品進行凈化[9,10,17]，這說明薄層層析作為樣品前處理的一種方法逐漸被主流實驗室認可。考慮到辣椒粉中的色素可以明顯直觀的顯示當前待測物蘇丹紅的分離凈化效果，為此，首先測試了辣椒粉中提取物凈化分離的效果。圖2顯示了四組分混合標準溶液、辣椒粉樣品空白或加標提取液分別處于點狀上樣模式和條帶上樣模式下的TLC分離效果。試驗表明4種標準化合物經過展開分離位于條帶上寬度僅2mm左右區域，可以清晰觀察到4種蘇丹紅染料的靶區，蘇丹紅四組分相對比移值Rf均處于0.75處且相當恒定。辣椒粉中紅色和黃色色素與蘇丹紅四種化合物(5.0μg/mL)相比移動明顯延遲，證實了當前TLC層析條帶對樣品組分有效的凈化和分離。這些紅色和黃色物質根據其顏色和有關紫外檢測分析分別是葉黃素和胡蘿卜素。

注：a 空白辣椒粉提取物和四組分蘇丹紅(10 μg/mL)點狀點樣分離效果；b 加標辣椒粉提取物和四組分蘇丹紅(10.0 μg/mL以及5.0 μg/mL)；c 空白辣椒粉提取物和四組分蘇丹紅條帶點樣效果；d 加標辣椒粉提取物和四組分蘇丹紅(5.0 μg/mL)。展開條件(正己烷/丙酮/冰乙酸=65∶35∶1)。

針對高油脂含量的辣椒油樣品，圖3顯示了混合標準溶液、辣椒油樣品提取液分別處于點狀點樣模式和條帶點樣模式下的TLC分離效果。試驗表明4種標準化合物可以與油脂中大部分的雜質色素分開，在該板中加入的4種蘇丹紅染料標準物質也位于同一Rf區，清晰地觀察到4種蘇丹紅染料的靶區，但其寬度有所增加，寬度擴展到約5～7mm左右。與低油脂含量加標樣品相比，這一結果可能是由于在高濃度的油脂干擾下待測組分在層析條帶分離效能受到影響，顯示出油脂基質對當前層析凈化條帶的干擾明顯，一定程度上降低了層析條帶的分離屬性。油脂中主要干擾物質主要有多種脂類、植物甾醇、角鯊烯等[18]。本實驗中油脂主要的干擾基質已與4種蘇丹紅組分完全分離，而這些物質被認為是對質譜分析產生明顯的基質干擾。由圖3可知到位于下部的油區，目標化合物位移至上部，但目標區的寬度明顯大于辣椒粉提取物的寬度。

注：A：辣椒油油脂樣品點狀點樣2平行和標準2點樣平行，10 ug/mL，B：辣椒油油脂樣品條帶的上樣。

2.4 凈化效果的比較

固相萃取是一種有效可靠的樣品凈化手段，商業化的固相萃取柱結合有關自動裝置可以獲得較為滿意的重現性和高通量。對本研究選擇的污染物蘇丹紅而言，盡管蘇丹紅染料的凈化用固相萃取盒種類繁多，但通常選擇正相SPE是因為蘇丹紅Ⅰ和蘇丹紅Ⅱ在中性極性官能化聚合物[1,19]上保留較好，GB/T19681—2005使用中性氧化鋁柱可以對辣椒粉油等樣品實現凈化[1]。然而，在實際樣品檢測中，中性氧化鋁柱表現并不令人滿意，特別針對高油脂含量樣本，其洗脫流出物仍然有較多的基質干擾物質，其中大部分為脂類化合物。為了進行考查本研究凈化策略的效果，故采用蘇丹紅專用凈化小柱作為比對，對辣椒粉和辣椒油樣品分別進行SPE與薄層層析凈化。比較蘇丹紅專用柱和當前紙基薄層凈化溶液，萃取物的目視凈化效果表明，兩種凈化方法在均可以獲得澄清透明的凈化溶液，對兩種凈化方式而言，大部分的肉眼可見雜質已被凈化洗脫完全，見圖4。然而，還有一些基質干擾化合物不是直接可見的，因此有必要進一步通過儀器的信號噪音比等指標考查評估凈化效率。

注：a 辣椒粉提取液；b 辣椒粉提取液的SPE凈化效果；c 辣椒粉提取液的TLC凈化效果；d 辣椒油正己烷稀釋液；e 辣椒油的SPE凈化效果；f 辣椒油的dTLC凈化效果。

圖5 液相色譜-串聯質譜測定4種蘇丹紅的總離子流圖

根據1.5中的條件建立了4種蘇丹紅的液質聯用快速分析方法，從圖5可以看到4種蘇丹紅染料峰形良好，滿足檢測要求。為了進一步考察SPE和TLC方法的凈化效果，對經過上述前處理方法的辣椒油樣品進行了LC-MS/MS分析，以基質效應(Martrix effect，ME)對凈化效果進行驗證。基質效應是由基質中干擾物與分析物的色譜共流出所導致的質譜信號干擾現象，其計算公式為ME=(基質空白溶液加標信號強度/空白溶劑加標信號強度)×100%。從表2可知，TLC方法能夠顯著降低4種蘇丹紅的基質效應，4種蘇丹紅基質效應范圍為67.6%～91.2%，而SPE方法仍然具有較強的基質抑制作用，如蘇丹紅Ⅱ達到了32.6%，顯著降低了方法的靈敏度。

表2 不同凈化方式的對蘇丹紅基質效應的影響

表3顯示了2種方法在處理時間、溶劑消耗方面的差異性，可以看出與常規固相萃取方法相比，當前開發的柔性紙基凈化條帶方法具有明顯優勢。

表3 不同凈化方式的時間與溶劑消耗對比

2.5 最低定量限、線性范圍與回收率分析表現

根據儀器分析工作曲線斜率并結合實際表現，在TLC凈化方法下，辣椒油中蘇丹紅Ⅰ～Ⅲ的定量限均為1.0μg/kg，蘇丹紅Ⅳ的定量限為2.0μg/kg，線性范圍在0.002～0.5mg/kg。對當前凈化策略下3種加標濃度(2、10、200μg/kg)的加標樣品進行了回收試驗。證明當前分析方法可以滿足國標方法的要求[20]。如圖6所示，加標回收率(外標法)在63%～85%，說明當前分析方法能夠滿足分析要求。其中蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅Ⅳ回收率較低，可能與TLC條帶上吸附性較強有關，在今后實驗中我們可以繼續改進洗脫液配比，從而進一步提升蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅Ⅳ的回收水平。

圖1 四種蘇丹紅染料在兩種加標水平上回收率表現(n=5)

3 討論與結論

有研究人員發現，測定油脂樣本如辣椒油樣品時，無論使用歐盟03/99文件對蘇丹紅的檢驗方法以及《食品中蘇丹紅染料的檢測方法-高效液相色譜法》(GB/T19681—2005)，對色譜柱的柱效影響很大。原因是植物油脂類黏度大，易于成膜，只要極少量的油脂通過色譜柱，易被柱子的微孔聚硅烷固定相吸附，造成流動相移動受阻，導致柱壓升高，對檢測結果造成影響。所以，測定這些油脂樣品時，樣品數量不宜過多，且測試完后，需要長時間用流動相沖洗色譜柱，使其回復到正常柱壓[21]。而本方法建立的凈化策略可以對待測底物和油脂基質實現完全分離凈化，樣品中油脂清除干凈，液相色譜柱柱壓回復良好，表明當前方法對儀器的良好兼容性。

雖然在LC-MS或GC-MS中，應用基質匹配校準標準實際上是避免基質效應的最常用方法，但是通過改進樣品制備技術以提供可靠的痕量檢測結果更為有用。當前研究表明，作為一種快速的前處理替代方法，高效薄層色譜法顯示出良好的潛力，被證明是一種經濟、可靠和快速的方法。通過分離-裁切-洗脫目標化合物區，當前開發的柔性紙基色譜對基質的清除過程非常有效，同時也能達到高通量的清除。只需要很小的樣品體積，并且每個樣品僅需要大約1～5mL的溶劑消耗。此外，目前制造的TLC紙基條帶是具有成本效益的，根據樣品的類型的不同可以靈活的設計目標化合物的靶標區域。對于原料辣椒粉樣品，由于萃取物校準非常干凈，所以分析校準幾乎可以用純溶劑標準進行。因此，可以避免基體效應。對于高油脂類樣品，目前的凈化策略提供了更簡單的制備工藝，但是這種方法還需要進一步改進。

通過與SPE比較，2種基質中4種蘇丹紅化合物的平均回收率在63%～85%之間，相對標準偏差小于10%，證實了有效的凈化。目前的一次性紙基薄層條帶有效地降低了基質效應，這項技術仍在發展中，目前制造的紙基板還需要進一步改進。但是，在痕量分析的其他領域，如多環芳烴或真菌毒素方面，它具有很大的改進和擴展潛力。所開發的帶有不同改性固定相修飾的一次性紙基條帶不僅可用于液相色譜，而且拓展應用于氣相色譜-質譜等儀器分析平臺，對于一些高復雜基質樣品如水產品或環境樣品將是下一個挑戰。