不穩定型心絞痛患者miR-9-3p水平及臨床意義

李斯 孫雅楠

(唐山市工人醫院 1心內四科，河北 唐山 063000；2內分泌二科)

miR-9-3p是microRNA(miR)家族成員之一，其基因定位于人15號染色體。目前研究證實血漿中miR-9-3p能夠參與機體膽固醇代謝、調節心肌細胞血管新生能力及心肌的生物學功能〔1～3〕。冠心病(CHD)患者血漿miR-9-3p表達水平的研究鮮有報道。本研究分析冠狀動脈病變嚴重程度Gensini評分與血漿miR-9-3p表達水平的相關性，旨在探討血漿miR-9-3p水平在CHD病情評估及診療中的價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 2014年1月至2015年6月唐山市工人醫院心內科就診的不穩定型心絞痛(UA)患者50例為UA組，納入標準：(1)參照2011《美國心臟學會/美國心臟病學會不穩定型心絞痛/非ST段抬高心肌梗死指南》及加拿大心絞痛分級3/4級標準，且必須具有以下至少一個特征：①1個月內原有心絞痛加重或發作頻繁(發作頻率增加，時間延長，程度加重)；②病程在1個月以內新發生的心絞痛(從無心絞痛，或有心絞痛病史但在半年內未發生心絞痛)；③靜息型心絞痛：心絞痛發生在休息或安靜狀態；④發作持續時間相對較長，含硝酸甘油效果欠佳，病程在1個月內。(2)冠狀動脈造影顯示至少一支冠狀動脈血管直徑狹窄≥50%。排除標準：(1)先天性心臟病、心臟瓣膜病患者、嚴重充血性心力衰竭〔紐約心臟病協會(NYAH)分類Ⅳ級〕或心源性休克。(2)伴有腎臟疾病、肝臟疾病、免疫性疾病、惡性腫瘤、血栓性疾病、嚴重貧血和出血性疾病等；(3)伴有各種急慢性炎癥及創傷等情況；(4)血壓≥180/110 mmHg者。同期年齡、性別與之相匹配的健康體檢人員30例為對照組。本研究由唐山市工人醫院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。

1.2標本采集 研究對象均禁食8 h，于冠脈造影前，清晨空腹肘靜脈采血。

1.3冠脈造影檢查 患者均具有冠狀動脈造影指征且無禁忌證，由經驗豐富的心血管介入醫師行冠狀動脈造影術，必要時行球囊擴張及支架植入術。根據世界衛生組織(WHO)推薦的美國AHA血管分段標準將冠狀動脈分為15段，根據Gensini評分準則確定冠狀動脈粥樣硬化的嚴重程度，將病變血管分為左主干、左前降支、回旋支和右冠狀動脈；每支血管根據狹窄程度進行分值設定：管腔狹窄≤25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計4分，76%～90%計8分，91%～99%計16分，100%完全閉塞計32分；不同節段冠狀動脈乘以相應系數：左主干病變×5.0；左前降支近段×2.5，中段×1.5，遠段×1.0；第一對角支×1.0；第二對角支×0.5；左回旋支近段×2.5，中段×1.5，遠段和后降支均×1.0，后側支×0.5；右冠狀動脈近、中、遠段和后降支均×1.0。Gensini評分為各節段冠狀動脈血管分值之和，得分越高說明狹窄程度越嚴重。

1.4血漿總RNA的提取 使用mirVana Paris試劑盒提取血漿總RNA，按照說明書操作，置于-80℃冰箱凍存。

1.5cDNA合成 應用實時熒光定量(qRT)-聚合酶鏈反應(PCR)(Taqman探針法)配制RT-PCR反應體系，總反應體系共8 μl，10×緩沖液0.8 μl、dNTP 0.2 μl、抑制劑0.1 μl、RNA 4.5 μl、無水RNase 0.4 μl、RNA引物1.5 μl、RTase 0.5 μl，全過程需在冰浴上操作。反應條件為：16℃ 60 min、42℃ 60 min、85℃ 5 min、4℃循環。

1.6qRT-PCR 配制qRT-PCR 反應體系 2× TaqMAN universal PCR Master混合物10 μl、cDNA 4 μl、無水RNase 5 μl、TaqMAN探針1 μl，總反應體系共20 μl；反應條件為：95℃10 min起始模板預變性，95℃15 s中模板變性、60℃60 s退火循環40次；每個樣本均做副管，重復3次，記錄實驗CT值，取平均值，后經2-△CT轉換后進行統計學分析。

1.7統計學方法 采用SPSS17.0及GraphPAD Prism5.0 統計軟件進行χ2檢驗、t檢驗、Mann-Whitney檢驗；應用受試者工作特征(ROC)曲線分析計算曲線下面積(AUC)和95%可信區間(CI)；相關性采用Spearman相關分析和多元逐步回歸分析。

2 結 果

2.1兩組基本資料比較 兩組性別、年齡、空腹血糖(FPG)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、舒張壓(DBP)比較未見顯著性差異(P>0.05)。兩組總膽固醇(TC)、收縮壓(SBP)水平存在顯著性差異(P<0.05)(表1)。

表1 兩組基本特征

2.2兩組血漿miR-9-3p的表達水平 UA組血漿miR-9-3p的表達水平〔0.001 9(0.001 3～0.002 3)〕與對照組〔0.003 2(0.002 5～0.005 7)〕存在顯著性差異(U=186.00，P<0.01)。

2.3ROC曲線分析miR-9-3p對UA的診斷價值 AUC為0.88(95%CI，0.80～0.95，P<0.05)，說明miR-9-3p對UA診斷有一定準確性(圖1)。

2.4血漿miR-9-3p 表達水平與UA各因素相關性 血漿miR-9-3p與年齡、性別、FPG、TC、TG、HDL-C、SBP、DBP未見顯著相關性(r=0.22、-0.19、-0.09、-0.21、-0.21、-0.01、-0.10、-0.04，均P>0.05)，與LDL-C、Gensini評分負相關(r=-0.41、-0.39，均P<0.05)。

圖1 ROC曲線分析血漿miR-9-3p對UA 的診斷價值

2.5Gensini評分與血漿miR-9-3p 表達水平相關性 以UA組Gensini評分為因變量，血漿miR-9-3p、年齡、性別、FPG、TC、TG、HDL-C、LDL-C、SBP、DBP為自變量進行多元逐步回歸分析，Gensini評分與血漿miR-9-3p表達水平呈顯著負相關(r=-0.39，P<0.05)。

3 討 論

miR廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質的短序列RNA，miR具有較高的穩定性，即使在反復凍融(4～-80℃)、pH改變及DNA和RNA裂解酶等極端條件下也不易降解，能夠穩定地存在于細胞及循環系統中〔4〕。同一個體在相同狀態下血漿miR表達譜大致相同，在疾病狀態下，miR會選擇性地從組織細胞釋放到外周血中發揮作用或通過血液傳遞到受體細胞發揮作用〔5〕，這就使得血漿中miR的表達水平發生變化，且血漿中miR變化要早于蛋白類標記物〔6〕，以上特點使血漿miR具有成為一種全新疾病檢測標記物的潛能。

目前國際關于miR與CHD研究的報道顯示，在CHD發病過程中血漿miR表達水平會發生顯著變化，并與冠脈病變嚴重程度具有相關性，在CHD診斷及病情評估方面起到重要作用。Chen等〔7〕研究顯示，與健康人群相比，急性心肌梗死(AMI)患者血漿miR-499表達水平顯著升高，并與Gensini評分顯著正相關。Wang等〔8〕的研究顯示，AMI患者血漿中miR-21-5p與miR-361-5p表達水平顯著升高，miR-519e-5p 表達水平顯著下降，ROC曲線分析顯示以上3種microRNA對AMI均具有一定診斷意義。Ding等〔9〕研究發現CHD患者血漿miR-125b表達水平下降，Gensini評分與miR-125b表達水平負相關。Wang等〔10〕研究顯示AMI病人血漿miR-133a表達水平顯著升高，ROC曲線分析顯示，血漿miR-133a對于CHD的診斷具有較高準確性。還有研究報道顯示 CHD 患者較胸痛患者血漿miR-155表達水平顯著降低，Spearman相關分析顯示其與Gensini評分顯著負相關〔11〕。Gensini評分是目前廣泛應用于評估CHD病變程度和冠狀動脈血管受累范圍的指標。

miR-9-3p最初在腫瘤性疾病中研究較多，miR-9-3p在腫瘤形成的病理過程中參與血管新生，目前研究顯示miR-9-3p在心血管發育乃至心血管疾病的病理過程中發揮一定作用。研究表明miR-9-3p可以通過靶向抑制心肌細胞血小板衍生生長因子受體-β信號，導致心肌細胞旁分泌血管新生能力顯著降低〔12〕。研究表明miR-9-3p的靶向抑制基因包括核因子激活T細胞c3和心肌素，兩者是共同構成心肌肥厚的主要因素，miR-9-3p可以通過抑制核因子激活T細胞c3和心肌素的表達，減弱心臟肥大并改善心臟功能〔13〕。研究表明miR-9-3p也可以通過靶向抑制脂肪酰輔酶A(ACAT)的基因表達，調節膽固醇代謝穩態〔3〕，ACAT1的過度表達能夠導致細胞內堆積過量膽固醇，促進巨噬細胞向泡沫細胞分化，最終導致動脈粥樣硬化〔14〕。研究表明，在衰老的人臍靜脈內皮細胞中miR-9-3p表達水平顯著升高〔15〕，miR-9-3p能夠通過激活磷酸腺苷依賴的蛋白激酶(AMPK)信號通路促進血管生成〔16〕，以上研究結果均證實血漿miR-9-3p與冠狀動脈粥樣硬化性疾病密切相關。

綜上，UA患者血漿miR-9-3p表達水平顯著降低對于UA診斷有一定準確性，且Gensini評分與血漿miR-9-3p表達水平呈負相關。本實驗并未闡明miR-9-3p參與CHD形成的具體機制，在今后的研究中應擴大樣本量，加入穩定型心絞痛及AMI病例和細胞功能實驗，進一步明確miR-9-3p在CHD發病中的作用。