當歸揮發油對自發性高血壓大鼠脂質代謝相關基因Tnfaip8l2、Ahsg表達的影響

曲強 紀祿風 伊琳

(1甘肅中醫藥大學中西醫結合學院，甘肅 蘭州 730000；2甘肅省人民醫院急診科)

原發性高血壓(EH)作為心血管病的危險致病因素之一，常引起心、腦、腎等多個靶器官的損害〔1〕。脂質代謝紊亂是高血壓發生的易患因素〔2〕，高血壓和脂質代謝紊亂經常合并存在，聯系緊密。它們能夠共同影響如缺血性心肌病、腦血管意外、腎臟損害(缺血性)等疾病的進程。大量的研究表明體重減輕會降低血壓〔3〕。

當歸是甘肅的道地藥材，對心腦血管及血液代謝等方面具有調節作用。本實驗小組前期研究〔4〕證實當歸具有輔助降壓的作用，并且在分析當歸處理自發性高血壓大鼠(SHR)的基因表達譜中發現了腫瘤壞死因子α誘導8樣分子2(Tnfaip8l2)基因。前期基因芯片研究中，筆者也發現當歸可使血清胎球蛋白A(Ahsg)、Toll樣受體(TLR)3等動脈粥樣硬化抑制因子的表達上調〔5〕。根據最新進展〔6〕筆者發現，高脂飲食誘導小鼠模型時，當歸能抑制其體重增長，改變脂肪組織相關性基因的表達，并對肥胖癥的發展起到了抑制作用。本研究通過分析當歸揮發油對SHR肝臟脂質代謝相關基因Tnfaip8l2、Ahsg表達的影響，闡述當歸揮發油對SHR脂代謝的改善作用及其機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 24只SPF級雄性SHR，8周齡，體重180～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限責任公司,動物合格證號SCXK(京)2012-0001，動物檢疫合格證No.1100562901。8只SPF級正常血壓雄性Wistar大鼠，體重180～220 g，購自甘肅中醫藥大學實驗動物中心，動物合格證號SYXK(甘)2011-0001。

1.1.2實驗藥物與試劑 當歸購自甘肅省岷縣，采用超臨界二氧化碳(CO2)萃取法，由甘肅中醫藥大學科研實驗中心提取當歸揮發油(藁本內酯含量>75%)。阿托伐他汀鈣片(北京嘉林藥業股份有限公司，國藥準字H19990258)，Tnfaip8l2、Ahsg抗體(北京博奧森生物有限公司)，Tnfaip8l2引物(TaKaRa公司，貨號5005)，Ahsg引物(易錦生物，貨號RmiRQ9003)，qRT-PCR儀(美國，伯樂，貨號SORVALL TENSCO)，高效RIPA裂解液(索萊寶，貨號R0010)，BCA濃度測定試劑盒(索萊寶)，聚丙酰胺配膠試劑盒(索萊寶)，Western印跡儀(美國，伯樂)，Power Lab ML125/R無創尾動脈血壓器(澳大利亞，AD Instruments公司)，低溫搖床，低溫離心機。

1.2方法

1.2.1分組和給藥 本研究的起止時間為2017年10月至2018年4月，實驗周期為6個月。將SHR和Wistar大鼠于SPF級動物房適應性飼養1 w后，將SHR隨機分為模型組、當歸揮發油組、阿托伐他汀鈣組，每組8只；Wistar大鼠作為對照組。模型組、對照組不給予任何藥物處理。當歸揮發油組、阿托伐他汀鈣組根據實驗鼠體表面積最終確定給藥劑量，分別給予當歸揮發油乳劑(吐溫-80助溶)100 mg/(kg·d)(含10%當歸揮發油)、阿托伐他汀鈣溶液60 mg/(kg·d)灌胃。每日給藥1次，每周給藥7 d，連續給藥4 w，并隨著大鼠體重變化每周按時調整給藥劑量。每周第7天檢測大鼠尾動脈血壓，每周于同一時間點進行測量，每只大鼠每次測量血壓5次，取平均值記錄。實驗給藥期間，各組大鼠標準飲食，自由飲水。

1.2.2樣本采集及檢測方法

1.2.2.1血樣采集及血脂檢測 給藥4 w后將大鼠禁食、不禁水12 h，采用3%水合氯醛(避光)腹腔注射，麻醉后腹主動脈采血并分離血清，用Lisa300全自動生化分析儀檢測血清總膽固醇(TC),三酰甘油(TG)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平。

1.2.2.2肝臟標本的制備 腹主動脈采血后將大鼠頸椎脫臼處死，開胸取出肝臟組織，10%甲醛溶液固定，石蠟組織包埋對肝臟組織進行HE染色，觀察肝臟組織病理學變化。

1.2.2.3肝臟蛋白的提取與檢測 大鼠處死后，取肝臟組織50 mg，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后，加0.5 ml高效RIPA裂解液(含1%PSMF)冰上裂解20 min，4℃離心(13 000 r/min，10 min，d=12.5 cm)后得上清液為總蛋白，95℃水浴鍋煮10 min，同時采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，根據蛋白濃度計算上樣量，而后采用免疫印跡法檢測Tnfaip8l2、Ahsg蛋白水平。以GAPDH 作為內參照，進行半定量分析，比值表示其相對含量。

1.2.2.4肝臟總RNA的提取與檢測 采用qRT-PCR法檢測大鼠Tnfaip8l2、Ahsg mRNA表達水平。取SHR肝臟組織50 mg，DEPC水沖洗后，按TRIzol一步法提取總RNA，紫外分光光度計測其純度與濃度，其中260/280的比值在1.8～2.0代表其純度較好；采用1%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA的完整性。總RNA提取后，采用頸環結構的MegaPlexTMRNA反轉錄引物混合物進行反轉錄，反轉錄結束后按照miRNA RT-PCR反應體系進行擴增，以GAPDH作為內參對照，進行PCR產物的半定量分析，反應條件為95℃ 10 min(預變性)，95℃ 15 s(變性)，60℃ 30 s(退火),75℃ 30 s(延伸)，75℃ 1 min(終極延伸)，共40個循環，引物序列：Tnfaip8l2正向：5′-AGTCCTGTTCCACCCGATCAC-3′;反向：5′-CACTATTCGAAATCCACTTGACCTG-3′;Ahsg正向:5′-GGTGCTCCTTTGTTTTGCTC-3′，反向:5′-CAGCCTGAATCCCTGAAGGG-3′;GAPDH正向:5′-AGGCCGGTGCTGAGTATGTC-3′，反向5′-CTGCCTGAATCCCTGAAGAA-3′。采用2-△△ct法計算Tnfaip8l2、Ahsg mRNA的表達水平。

1.3統計學方法 采用SPSS20.0軟件，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析及重復測量方差分析，并行兩兩比較。

2 結 果

2.1各組用藥前后收縮壓比較 各組給藥情況和時間在大鼠收縮壓中主效應顯著，差異有統計學意義(P<0.05)。給藥第1、2、3、4周，當歸揮發油組收縮壓均明顯低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)，阿托伐他汀鈣組收縮壓與模型組對比無明顯改變，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組鼠尾動脈收縮壓比較

與模型組比較：1)P<0.05；下表同

2.2各組血脂水平比較 與對照組比較，模型組血清TC、TG、LDL-C水平高于對照組，血清HDL-C低于水平組，但無統計學差異(P>0.05)；與模型組比較，各用藥組的TC、TG、LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，但也未見顯著性差異(P>0.05)。見表2。

2.3當歸揮發油對各組肝臟組織形態學的影響 對照組肝小葉結構正常，肝細胞正常。與對照組比較，模型組可見脂肪變性，肝細胞內有小泡。當歸揮發油組可見肝竇擴張，糖原分解，脂肪變性消失。阿托伐他汀鈣組未見明顯異常。見圖1。

表2 各組血脂水平比較

圖1 各組肝臟組織形態學比較(HE，×400)

2.4各組肝臟Tnfaip8l2 及Ahsg mRNA水平比較 與模型組比較，當歸揮發油組、阿托伐他汀鈣組的Tnfaip8l2及Ahsg mRNA表達水平均明顯升高，對照組Tnfaip8l2 mRNA水平明顯升高、Ahsg mRNA水平明顯減少(P<0.05)，當歸揮發油組、阿托伐他汀鈣組之間Tnfaip8l2及Ahsg mRNA表達水平比較無統計學差異(P>0.05)。見表3，圖2。

表3 各組Tnfaip8l2、Ahsg mRNA相對含量比較

1、2:對照組；3、4：模型組；5、6：當歸揮發油組；7、8：阿托伐他汀鈣組圖2 各組肝臟RNA電泳圖

2.5各組肝臟Tnfaip8l2及Ahsg蛋白水平比較 模型組肝臟Ahsg蛋白水平明顯高于對照組、Tnfaip8l2蛋白水平明顯低于對照組(P<0.05)，當歸揮發油組、阿托伐他汀鈣組Tnfaip8l2及Ahsg蛋白表達水平均明顯高于模型組(P<0.05)，當歸揮發油組與阿托伐他汀鈣組間比較無統計學差異(P>0.05)，見圖3，表4。

圖3 各組肝臟Tnfaip8l2、Ahsg蛋白相對含量的表達

表4 各組Tnfaip8l2、Ahsg蛋白相對含量比較

3 討 論

隨著全球高血壓患病率的不斷上升，高血壓的治療方案已經不能滿足人們對健康的需求。中醫“治病求本”和“未病先防”的理念為中藥治療高血壓病帶來了新的契機。當歸揮發油的主要成分是藁本內酯及阿魏酸鈉，可清除體內氧自由基，降低氧化應激性損傷與抗細胞凋亡，緩解腦細胞的損傷。當歸制劑在降低血壓及改善臨床癥狀上具有明顯的療效,對調節血脂異常和免疫功能方面具有雙向作用,對致動脈粥樣硬化指數及血液流變學指標有一定的下調作用〔7〕。并且有研究發現，當歸與苯那普利聯合降壓效果明顯好于單用苯那普利的療效〔8〕。血管內皮功能很可能是高血壓與高脂血癥聯系的紐帶。血管腔的表面覆蓋著內皮組織，具有調節動脈血管收縮性、 穩定血流及重塑血管結構等功能。大量文獻報道〔9〕證實，血清游離脂肪酸濃度升高對主動脈壓力感受反射有急性損害作用。脂代謝出現異常時，伴隨著血流動力學改變，易合并動脈粥樣硬化等疾患〔10〕。當脂代謝合并動脈粥樣硬化時，血壓也隨之升高。動脈粥樣硬化、脂代謝紊亂、高血壓常同時存在，并互為因果。吳國泰等〔11〕在研究當歸揮發油對高血脂小鼠動脈粥樣硬化的保護作用中發現當歸揮發油能減輕肝細胞脂肪變性、胸主動脈內膜損傷及心肌纖維化,對動脈粥樣硬化斑塊形成具有抑制作用。Tnfaip8l2與血脂水平密切相關，Zhang等〔12〕研究發現 Tnfaip8l2 缺陷鼠的頸動脈內膜增生過程加速，認為 Tnfaip8l2 基因是潛在的動脈粥樣硬化抑制因子。Ahsg(α-Hs糖蛋白)在肝臟合成，具有抗炎、抑制鈣化、抗腫瘤、抑制胰島素信號通路等作用，與心血管疾病、肝硬化、脂肪肝等疾病密切相關〔13〕。本實驗小組前期研究〔5〕證實當歸具有輔助降壓的作用，同時在分析當歸處理后SHR基因表達譜中發現Tnfaip8l2 基因及Ahsg基因為上調的差異表達基因。石向慧等〔14〕發現當歸揮發油對SHR脂代謝有調節作用,可能通過上調TRIB1、Tlr3、AHSG等蛋白的表達量而抑制動脈粥樣硬化,改善SHR的脂代謝而達到降壓的目的。因此，推測當歸有可能通過這兩個動脈粥樣硬化抑制因子發揮作用。本研究顯示，Tnfaip8l2、Ahsg蛋白在當歸揮發油組、阿托伐他汀鈣組表達上調，故推測當歸揮發油可能通過影響脂代謝進而抑制動脈粥樣硬化來達到降壓的目的。經過當歸揮發油治療后，SHR的Tnfaip8l2、Ahsg含量上調，并可能通過某些信號通路或者轉導通路發生作用，至于這兩個基因是通過何種信號途徑實現上調的目的及他們內部的關聯，將是筆者下一步研究的重點。總之，當歸揮發油在治療老年病諸如高血壓及血脂異常方面具有獨特的優勢，本課題組將進一步探討高血壓和脂代謝發病的共同機制，并早日應用到臨床實踐中。