三磷酸腺苷結合盒G2調控肝癌細胞多藥耐藥的作用

趙鑫 陳樂彤 王靜 劉亮

(1河北省人民醫院超聲科，河北 石家莊 050000；2河北醫科大學第四醫院腫瘤研究所)

肝癌是世界范圍內常見的惡性腫瘤，具有發病率高、病死率高的特點〔1〕。手術、介入治療、靶向藥物治療及放化療是目前肝癌的常規治療方法。一些晚期肝癌患者或因其他原因無法行手術、介入治療的患者，化療成為其主要的治療方法。影響肝癌化療效果的因素有很多，其中藥物的毒副作用及肝癌細胞對化療藥物的耐藥是較重要的影響因素。探索肝癌多藥耐藥產生機制從而對其靶向干預，可以有效提高化療效果。目前研究發現，三磷酸腺苷結合盒(ABC)在腫瘤多藥耐藥產生過程中起著重要作用〔2，3〕，可以有效降低腫瘤細胞內的化療藥物濃度，從而產生耐藥，其中ABCB1及ABCG2與腫瘤多藥耐藥關系最為密切〔4～6〕。ABCG2參與多種腫瘤的多藥耐藥形成，且是側腹群(SP)細胞主要標志物〔7～9〕，參與腫瘤干細胞的形成；而ABCG2與肝癌多藥耐藥關系的研究鮮有報道。本文主要探討肝癌多藥耐藥形成機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 ABCG2(5D3)抗體購自美國Santa cruz公司；FITC標記的二抗購自美國Jackson ImmunoResearch；碘化丙啶(LOT：5338528)購自美國BD公司；FC500型流式細胞儀，美國Beckman Coulter公司。

1.2肝癌耐藥細胞培養 利用藥物濃度遞增細胞培養方法建立肝癌耐藥細胞，在肝癌細胞SMMC-7721培養液中加入阿霉素(ADM)，逐漸提高ADM濃度，濃度從0.001 μg/ml 提高至0.100 μg/ml，使細胞在0.100 μg/ml ADM中穩定生長，命名為SMMC-7721/ADM 細胞。

1.3MTT法檢測ADM對肝癌細胞生長的抑制作用 將細胞濃度為1×104個/ml且處于對數生長期的SMMC-7721或SMMC-7721/ADM細胞接種于96孔培養板中，待細胞貼壁后棄去上清液，分別加入不同濃度的ADM(0.001、0.005、0.010、0.050、1.000、5.000、10.000、50.000 μg/ml)，陰性對照組加入等體積生理鹽水，每孔總體積為200 μl，同時設置只加培養基的空白對照孔，每個藥物劑量設3個復孔，作用24 h后，棄去培養液，每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，培養液180 μl，繼續孵育4 h后終止培養，棄去培養液，每孔加入180 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min。以空白孔調零，選擇490 nm波長，在酶標儀上測定各孔光密度值A490。生長抑制率計算公式：生長抑制率(IR，%)=(1-用藥組A490/對照組A490)×100%。

1.4倒置顯微鏡下觀察SMMC-7721/ADM及其親代SMMC-7721細胞形態 將細胞濃度為1×105個/ml且處于對數生長期的SMMC-7721或SMMC-7721/ADM細胞接種于細胞培養瓶中，待細胞貼壁后利用倒置顯微鏡觀察細胞形態并拍照。

1.5流式細胞術(FCM)檢測細胞凋亡及細胞周期 將細胞濃度為1×106個/ml且處于對數生長期的SMMC-7721及SMMC-7721/ADM細胞，利用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次(1 000 r/min，5 min)，取1 ml細胞懸液，向其中加入DNA染液(碘化丙啶)1 ml，而后避光4℃染色30 min，利用冷PBS洗滌1次(1 000 r/min，5 min)，1 ml PBS懸浮細胞，上機流式細胞儀檢測。

1.6FCM檢測細胞中ABCG2蛋白表達 將細胞濃度為1×106個/ml且處于對數生長期的SMMC-7721及SMMC-7721/ADM細胞，利用冷PBS洗滌1次(1 000 r/min，5 min)，取細胞懸液1 ml，利用冷PBS洗滌1次(1 000 r/min，5 min)，100 μl PBS懸浮細胞，100 μl ABCG2抗體加入細胞懸液中，室溫孵育30 min，而后PBS洗滌細胞1次(1 000 r/min，5 min)，100 μl PBS懸浮細胞，100 μl FITC標記的二抗加入細胞懸液中，室溫避光孵育30 min，利用冷PBS洗滌1次(1 000 r/min，5 min)，1 ml PBS懸浮細胞，上機流式細胞儀檢測。以平均熒光強度表示細胞中蛋白表達量。

1.7統計學分析 采用SPSS11.5軟件行獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1MTT實驗檢測ADM抑制肝癌SMMC-7721細胞生長的IC50 MTT檢測結果顯示，ADM作用肝癌SMMC-7721細胞24 h的半數生長抑制濃度(IC50)為(1.11±0.09)μg/ml。

2.2肝癌耐藥細胞培養及形態學觀察 利用藥物濃度遞增細胞培養方法，歷時3個月，使細胞在0.1 μg/ml ADM中穩定生長，命名為SMMC-7721/ADM 細胞。倒置顯微鏡下觀察SMMC-7721/ADM細胞形態更不規則，細胞體積變大，細胞間隙增大，見圖1。

2.3MTT實驗檢測ADM抑制肝癌SMMC-7721/ADM細胞生長的IC50 不同濃度ADM作用SMMC-7721/ADM細胞24 h，IC50=(23.04±0.26)μg/ml。SMMC-7721/ADM細胞與其親代SMMC-7721細胞相比，對ADM的耐藥指數為20.76。

圖1 倒置顯微鏡下觀察細胞形態(×100)

2.4流式細胞術檢測細胞凋亡率 SMMC-7721/ADM細胞凋亡率(0.82±0.12)%，與其親代SMMC-7721細胞凋亡率(0.84±0.14)%相比無顯著性差異(P>0.05)。

2.5流式細胞術檢測細胞周期 SMMC-7721/ADM細胞周期G0/G1期(46.86±0.49)%、S期(38.71±2.66)%及G2/M期(14.43±2.17)%；SMMC-7721細胞周期G0/G1期(49.97±0.51)%、S期(37.85±2.31)%及G2/M期(12.18±1.79)%。SMMC-7721/ADM細胞與其親代SMMC-7721細胞相比G0/G1期顯著減少(P<0.05)；而S期及G2/M期增高，但無統計學意義(P>0.05)。

2.6肝癌耐藥細胞及其親代細胞中ABCG2 蛋白表達 肝癌耐藥細胞SMMC-7721/ADM中ABCG2 蛋白表達水平(377.58±3.01)顯著高于其親代細胞SMMC-7721中的表達水平(332.50±13.96，P<0.05)。

3 討 論

目前引起腫瘤細胞多藥耐藥機制中研究較多且得到廣大研究者公認的機制主要有三方面，第一，細胞膜轉運蛋白介導的藥物外排機制；第二，凋亡調控基因調控機制，通過凋亡調控基因的調控使細胞逃脫藥物引起的細胞凋亡；第三，細胞酶調控機制。大量的文獻〔9～11〕顯示，細胞跨膜蛋白介導的細胞藥物外排作用，引起細胞內藥物的有效濃度降低，從而引起細胞耐藥的機制與大量癌細胞耐藥有關。細胞跨膜蛋白可以主動逆濃度梯度將細胞內藥物泵出到細胞外，從而降低細胞濃度。研究顯示，這類與細胞耐藥有關的跨膜蛋白多為ABC轉運蛋白家族成員〔10,11〕。而在ABC轉運蛋白家族中研究較多的與腫瘤細胞多藥耐藥有關的蛋白為ABCB1及ABCG2。

ABCG2與多種腫瘤細胞的多藥耐藥有關〔12,13〕，參與了腫瘤SP細胞形成并與腫瘤干細胞有關〔4,14〕。本研究結果顯示，SMMC-7721/ADM細胞對ADM產生耐藥，其耐藥機制考慮為細胞中ABCG2高表達從而引起外排ADM作用增強，導致細胞內ADM的有效濃度降低，從而產生耐藥。