ADAMTS9基因聯合去甲氧基姜黃素對肝癌細胞侵襲遷移及PI3K/PTEN/AKT信號的影響

徐卓 張萌 張志磊 賈聿明 王超 彭利

(河北醫科大學第四醫院肝膽外科，河北 石家莊 050011)

肝癌是常見的消化系統腫瘤之一，早期臨床癥狀不明顯，起病隱匿，進展迅速，確診時大部分患者已處于晚期或已發生遠處轉移，且近些年我國的肝癌發病率呈現上升趨勢〔1〕。腫瘤進展過程中，腫瘤細胞的侵襲及轉移能力發揮重要作用。因此，尋找有效的肝癌治療途徑具有重要意義。帶有血小板凝血酶敏感蛋白樣模體的解聯蛋白金屬蛋白酶(ADAMTS)9是ADAMTS家族成員之一，是該家族中結構最為保守的成員，在乳腺癌、胃癌等多種腫瘤中發揮抑癌基因樣作用〔2，3〕。肝癌組織中ADAMTS9下調表達，與發生及預后有關〔4〕，ADAMTS 9啟動子異常甲基化可能參與肝細胞癌的形成和進展〔5〕，但關于ADAMTS9對肝癌細胞生物學特性影響尚未明確。去甲氧基姜黃素(DMC)是姜黃素的衍生物，已被證實有確切的抗腫瘤活性，且可減輕一些腫瘤致癌因素對機體造成的損傷，也可抑制腫瘤侵襲和遷移〔6〕。有研究顯示，DMC可抑制肝癌細胞增殖、侵襲、遷移〔7〕。本研究旨在ADAMTS9過表達或DMC單獨或聯合對肝癌細胞侵襲、遷移及磷脂酰肌醇3-激酶/第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白/蛋白激酶B(PI3K/PTEN/AKT)信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器 RPMI1640培養基購自美國Corning；胎牛血清(FBS)購自杭州四季青；細胞計數試劑盒(CCK)8購自上海生工；去甲氧基姜黃素購自上海皓元；Transwell小室試劑盒購自美國Corning；Matrigel基質膠購自美國BD；ADAMTS9、增殖細胞核抗原(PCNA)、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、PI3K、PTEN和p-AKT抗體購自美國CST；酶標儀購自美國Bio-Rad。

1.2細胞株 人正常肝細胞HL-7702、肝癌細胞系HepG2、人肝癌低轉移MHCC 97-L細胞及人肝癌高轉移MHCC97-H細胞系均購自美國ATCC。細胞在含10%小牛血清的RPMI1640培養基中，于5%體積分數二氧化碳(CO2)、飽和濕度的培養箱中37℃恒溫傳代培養。

1.3細胞中ADAMTS9表達檢測 采用Western印跡法。細胞中加適量裂解液于冰上裂解反應30 min，Bradford法定量蛋白。蛋白樣品在100℃水浴中變性5 min，加適量上樣緩沖液，每孔道上樣30 μg，經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，經100 V濕轉1.5 h，轉膜完成后用5%的脫脂奶粉封閉膜1～2 h，加一抗(1∶500稀釋的ADAMTS9抗體)，4℃冰箱中過夜，加1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，室溫搖晃1～2 h，洗滌。暗室中壓上X線片，采用ECL化學發光法檢測，曝光約60 s，即刻進行顯影、洗片，掃描儀進行掃描并測定。Quantity軟件分析ADAMTS9蛋白與內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)灰度值，以其比值作為各個蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.4實驗分組及處理 MHCC97-H細胞分為4個處理組，即對照組、pcDNA3.1-ADAMTS9組、DMC和pcDNA3.1-ADAMTS9+DMC組。對照組細胞不經特殊處理。pcDNA3.1-ADAMTS9組轉染ADAMTS9的過表達載體48 h，轉染參照LipofectamineTM 2000轉染說明。DMC組使用40 μmol/L DMC處理細胞48 h。pcDNA3.1-ADAMTS9+DMC組用pcDNA3.1-ADAMTS9及40 μmol/L DMC共同處理細胞48 h。

1.5細胞活力檢測 采用CCK8法。以5×103/孔接種生長至對數期的MHCC97-H細胞于96孔板，常規培養24 h，按照1.4分組處理，每組設置5個重復孔，收集處理至規定時間的細胞，每孔中加入10 μl的CCK8溶液，培養箱孵育2 h，于450 nm，酶標儀測定吸光度值(A)。實驗重復3次。

1.6細胞侵襲能力檢測 采用Transwell小室檢測細胞侵襲能力。實驗分組及處理同上。Transwell小室置于24孔培養板，形成上、下兩室。上室面均勻鋪上50 μl由不含血清培養基稀釋的Matrigel，置于37℃培養箱中。將處理至規定時間的4組細胞濃度調整為2.5×105/ml，每個上室中加入細胞懸液100 μl，下室中加入含10%FBS的培養液500 μl，于37℃、5%體積分數CO2培養箱中孵育24 h。棉簽輕輕拭去上室面的細胞，依次經4%多聚甲醛固定、0.1%結晶紫染色后，隨機計數5個高倍視野下(×200)侵襲至濾膜下表面的細胞數，取均值。實驗重復3次。

1.7細胞遷移能力檢測 采用Transwell小室檢測細胞遷移能力。除了未鋪Matrigel，其他步驟同細胞侵襲實驗。

1.8PCNA、MMP-2、MMP-9、PI3K、PTEN和p-AKT蛋白表達檢測 方法同1.3。

1.9統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行方差分析及SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1ADAMTS9在肝癌細胞表達 肝癌HepG2、MHCC97-L和MHCC97-H細胞中ADAMTS9表達(0.204±0.021、0.165±0.018、0.074±0.010)均有不同程度的降低，與正常肝細胞HL-7702(0.602±0.056)比較，差異具有統計學意義(F=163.674，P=0.000)。見圖1。

圖1 Western印跡檢測肝癌細胞ADAMTS9蛋白表達

2.2pcDNA3.1-ADAMTS9轉染MHCC97-H細胞效果 pcDNA3.1-ADAMTS9組ADAMTS9的蛋白表達(0.625±0.059)顯著高于對照組(0.088±0.010，P<0.05)，而pcDNA3.1組ADAMTS9的蛋白表達(0.096±0.012)與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 pcDNA3.1-ADAMTS9轉染MHCC97-H細胞后ADAMTS9的蛋白表達

2.3過表達ADAMTS9或DMC對MHCC97-H細胞活力的影響 pcDNA3.1-ADAMTS9和DMC組MHCC97-H細胞活力(0.541±0.048、0.482±0.043)顯著低于對照組(0.754±0.065，P<0.05)，而pcDNA3.1-ADAMTS9+DMC組對細胞活力抑制更明顯(0.312±0.030)，且顯著高于pcDNA3.1-ADAMTS9和DMC組(P<0.05)。

2.4過表達ADAMTS9或DMC對MHCC97-H細胞侵襲及遷移能力的影響 pcDNA3.1-ADAMTS9組和DMC組細胞侵襲及遷移數均顯著低于對照組，而pcDNA3.1-ADAMTS9+DMC組細胞侵襲及遷移數均顯著低于pcDNA3.1-ADAMTS9組和DMC組(P<0.05)。見表1。

2.5過表達ADAMTS9或DMC對MHCC97-H細胞增殖及侵襲遷移相關蛋白表達的影響 pcDNA3.1-ADAMTS9組和DMC組細胞PCNA、MMP-2和MMP-9的蛋白表達均顯著低于對照組，而pcDNA3.1-ADAMTS9+DMC組細胞PCNA、MMP-2和MMP-9的蛋白表達均顯著低于pcDNA3.1-ADAMTS9組和DMC組(P<0.05)。見圖3，表2。

表1 過表達ADAMTS9或DMC對MHCC97-H細胞侵襲及遷移能力的影響

與對照組比較：1)P<0.05；與pcDNA3.1-ADAMTS9+DMC組比較：2)P<0.05，下表同

圖3 Western印跡檢測各組細胞 PCNA、MMP-2和MMP-9的蛋白表達

表2 PCNA、MMP-2和MMP-9的蛋白相對表達比較

2.6過表達ADAMTS9或DMC對MHCC97-H細胞PI3K/PTEN/AKT信號的影響 pcDNA3.1-ADAMTS9組和DMC組細胞PI3K和p-AKT的蛋白表達均顯著低于對照組，PTEN的蛋白表達顯著高于對照組(P<0.05)，而pcDNA3.1-ADAMTS9+DMC組細胞PI3K和p-AKT的蛋白表達均顯著低于pcDNA3.1-ADAMTS9組和DMC組，PTEN的蛋白表達均顯著高于pcDNA3.1-ADAMTS9組和DMC組(P<0.05)。見圖4，表3。

圖4 Western印跡檢測PI3K、PTEN和p-AKT的蛋白表達

表3 PI3K、PTEN和p-AKT蛋白的相對表達比較

3 討 論

ADAMTS9在血管內皮、心臟、卵巢等組織中有廣泛表達，定位于3p14.2-p14.3染色體，已有研究報道該區域在鼻咽癌、食管鱗癌等多種腫瘤中缺失〔8〕。乳腺癌中ADAMTS9的上調表達可抑制癌細胞轉移〔9〕；外源性的ADAMTS9表達可抑制結腸癌細胞增殖和遷移，阻滯細胞周期及誘導細胞凋亡，同時可抑制AKT信號通路〔10〕。這提示ADAMTS9是一個重要的抑癌基因，其可能在肝癌中發揮重要作用。本研究首先檢測了肝癌細胞ADAMTS9表達，發現肝癌細胞ADAMTS9均為低表達，在肝癌高轉移MHCC97-H細胞表達最低，因此選擇作為研究對象。

DMC為姜黃素的衍生物，具有抗纖維化、抗氧化、抗炎、抗癌等作用，其抗癌機制受到廣泛關注〔11〕。有研究發現，DMC可抑制多種惡性腫瘤的生長和轉移，如肺癌、肝癌、白血病等，且抗癌譜較廣，毒副作用小〔12，13〕。作為抗癌新藥，具有很好的應用前景。本研究結果提示ADAMTS9和DMC聯合可能是一種新的肝癌治療途徑。

腫瘤的侵襲及轉移是惡性腫瘤臨床治療的一個棘手難題。已有研究顯示DMC抑制腫瘤侵襲及轉移機制與降解細胞外基質蛋白水解酶有關〔14〕。MMP-2和MMP-9是MMPs家族成員之一，可特異性降解Ⅳ型膠原，肝癌中抑制MMP-2和MMP-9表達可降低癌細胞的侵襲及遷移能力〔15〕。PCNA為一種核蛋白，在細胞周期S期有廣泛表達，其表達程度可反映細胞的增殖能力，目前已在多種惡性腫瘤增殖活性檢測中有廣泛應用〔16〕。本研究結果顯示，過表達ADAMTS9及DMC均可下調PCNA、MMP-2和MMP-9表達，聯合對PCNA、MMP-2和MMP-9表達抑制更明顯。

PI3K/AKT信號在多種人類腫瘤中表達失調，AKT被PI3K磷酸化激活后可促進細胞增殖、侵襲和遷移，抑制細胞凋亡，是該通路的效應核心〔17〕。PTEN是一種重要的抑癌基因，可負反饋調節PI3K/AKT信號，其表達缺失可引起腫瘤進展、預后不良和淋巴結轉移〔18〕。PTEN能使PI3K去磷酸化，失去對AKT的激活，從而抑制PI3K/AKT信號，因此大多數學者稱之為PI3K/PTEN/AKT信號通路〔19〕。有研究顯示，羅格列酮可通過PI3K/PTEN/AKT通路抑制人肝癌HepG2細胞增殖〔20〕。ADAMTS9可通過抑制AKT/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路在胃癌中發揮功能性腫瘤抑制作用〔21〕。本研究結果提示ADAMTS9或DMC對肝癌細胞侵襲遷移的影響與PI3K/PTEN/AKT信號有關。

綜上，過表達ADAMTS9及DMC均可抑制肝癌細胞活力、侵襲和遷移能力，兩者聯用對細胞抑制作用更明顯，機制可能與下調PCNA、MMP-2和MMP-9及PI3K/PTEN/AKT信號通路有關。本研究提示過表達ADAMTS9及過表達ADAMTS9和DMC聯合可能是肝癌治療的新的途徑。但本研究內容有限，還需更多的體內、體外及臨床研究證實。