聯合應用小檗堿和二甲雙胍對miR-212介導的食管癌細胞遷移的影響

陳智 劉玉珍 齊博 劉尚國 趙寶生

(新鄉醫學院 1第一附屬醫院胸外科二病區，河南 衛輝 453100；2食管癌研究所；3河南省神經病學研究所)

根據臨床病理分型，我國食管癌多以鱗狀細胞癌為主〔1〕。食管癌具有高度侵襲性且易發生轉移，上皮-間質轉化(EMT)是腫瘤發生侵襲和轉移的主要方式。EMT即上皮細胞間質化，是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞并獲得遷移和侵襲能力的生物學過程〔2〕。研究發現，micro RNA(miR)異常表達參與腫瘤生物學進展〔3〕。人miR-212(has-miR-212)具有組織特異性，在不同腫瘤組織中表現為抑癌或促癌作用。研究發現，食管癌組織標本中miR-212表達水平升高與術后轉移早、生存期短、預后不良顯著相關〔4，5〕；另外，雷帕霉素等特定信號通路抑制劑無法阻斷食管癌中miR-212高表達介導的促進腫瘤轉移的表型。中藥提取物小檗堿對食管癌細胞具有抗增殖、促凋亡、抑制遷移的作用〔6〕。二甲雙胍不僅能夠治療糖尿病，其廣譜的抗腫瘤活性〔7〕在其他腫瘤中已有報道。因此，本文旨在進一步探討具有廣譜抗腫瘤作用的小檗堿與二甲雙胍聯合用藥對miR-212介導的食管癌細胞遷移能力的影響。

1 材料和方法

1.1材料 人食管癌KYSE-450細胞購自南京科佰生物技術有限公司。新生胎牛血清(FBS)購自Clark；RPMI1640培養基、磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)購自Corning；胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、青霉素、鏈霉素購自索萊寶科技有限公司；小檗堿購自上海源葉生物有限公司；二甲雙胍購自碧云天生物技術有限公司。人成熟型miR-212過表達慢病毒載體由上海吉瑪基因生物公司合成。單克隆兔抗E-cadherin、Vimentin、Twist1、GAPDH購自CST公司。二喹林甲酸(BCA)試劑盒、辣根過氧化物酶標記的兔抗免疫球蛋白(Ig)G抗體購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司。

1.2藥物配置 小檗堿用DMSO溶解，配置成50 mmol/L的貯存液，-20℃保存，使用前解凍，并用RPMI1640培養基稀釋到相應的工作濃度。二甲雙胍用PBS配備，制成1 mol/L的貯存液，使用前根據實驗所需濃度用PBS進行稀釋。

1.3細胞培養 使用含有10%FBS和100 U青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基，置于37℃、飽和濕潤空氣、體積分數為5%CO2的培養箱中進行常規培養。待細胞融合至70%～80%，用胰酶消化處理后，計數傳代。

1.4慢病毒轉染 選取處于對數生長期的細胞用于實驗。2×105個KYSE-450細胞于轉染前24 h接種在6孔板中。根據上海吉瑪基因的細胞轉染說明書進行實驗操作，并用5 mg/ml的嘌呤霉素對轉染細胞進行篩選，從中篩選出能夠穩定高表達miR-212的KYSE-450細胞用于后續實驗。

1.5Transwell實驗 檢測藥物處理后對細胞遷移的影響 按Transwell說明書操作：①取對數生長期的細胞，經胰酶消化成單個懸浮細胞后，用無血清培養基重懸，計數；②向Transwell小室的上室內加入細胞懸液(含1×105個細胞)，加入無血清的RPMI1640稀釋至200 μl；③下室加入600 μl含10% FBS的完全培養基，另外上室和下室中按比例加入稀釋過的藥物；④置于37℃、5%CO2的培養箱中培養36 h后取出小室；⑤將小室浸入4%多聚甲醛中固定15 min，結晶紫染色8 min，晾干，并吸走小室內的液體，用棉棒將上室內的細胞擦去；⑥每個培養孔隨機選5個視野，置于熒光顯微鏡下進行拍照，并計算各視野下的細胞數，每組實驗重復3次。

1.6Western印跡法檢測藥物處理后EMT相關蛋白的表達 將處于對數生長期的細胞按照上述分組進行處理48 h，用放射免疫沉淀法(RIPA)裂解細胞后提取細胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度(根據BCA試劑盒說明書進行操作)。以每組30 μg的等量蛋白樣品上樣，用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電脈(SDS-PAGE)分離蛋白，轉膜，再用5%的脫脂奶粉在常溫下封閉1 h，加入E-cadherin、Vimentin、Twist1(1∶1 000)等一抗4℃過夜，用TBST洗膜后(10 min×3次)，加入辣根過氧化物酶標記兔抗IgG(1∶8 000)室溫搖床上孵育1 h，再洗膜30 min，除去未結合的二抗，最后根據說明書按照1∶1配置電化學發光(ECL)工作液，用凝膠成像儀成像。

1.7統計學處理 采用SPSS22.0軟件進行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1小檗堿、二甲雙胍對miR-212介導的KYSE-450細胞遷移的影響 與對照組比，過表達miR-212后促進了細胞遷移能力(P<0.05)。不同濃度小檗堿(10 μmol/L和20 μmol/L)作用于過表達miR-212的KYSE-450細胞后，與miR-212組(未加藥處理)相比，呈濃度-劑量依賴性出現抑制細胞遷移能力的作用(P<0.001)。給予10 mmol/L和20 mmol/L二甲雙胍處理后，與miR-212組(未加藥處理)相比，其抑制作用具有濃度-劑量依賴性，隨濃度增加抑制作用逐漸明顯(P<0.001)。見圖1、2，表1。

圖1 小檗堿對過表達miR-212的KYSE-450細胞遷移的影響(結晶紫染色，×100)

圖2 二甲雙胍對過表達miR-212的KYSE-450細胞遷移的影響(結晶紫染色，×100)

2.2小檗堿和二甲雙胍聯合對miR-212介導的KYSE-450細胞遷移的影響 過表達miR-212的KYSE-450細胞遷移細胞數〔(555.67±5.69)個〕顯著高于對照組〔(363.67±5.13)個，P<0.05)〕。 miR-212+10 μmol/L小檗堿組細胞遷移細胞數〔(419.32±4.00)個〕和miR-212+10 mmol/L二甲雙胍組細胞遷移細胞數〔(504.27±5.29)個〕均顯著低于對照組，且顯著高于miR-212+10 μmol/L小檗堿+10 mmol/L二甲雙胍組〔(197.36±5.57)個〕，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

表1 小檗堿、二甲雙胍對過表達miR-212的KYSE-450細胞遷移的影響個，n=3)

與對照組比較：1)P<0.05；與miR-212組(未加藥處理)比較：2)P<0.05；下表同

圖3 小檗堿和二甲雙胍聯合對miR-212介導的KYSE-450細胞遷移的影響(結晶紫染色，×100)

2.3Western印跡法檢測藥物處理后E-cadherin、Vimentin、Twist1蛋白水平 與對照組相比，過表達miR-212組(未加藥處理)E-cadherin表達下調(P<0.05)，Vimentin、Twist1表達上調(P<0.05)；兩種藥物聯合處理后，與過表達miR-212組(未加藥處理)相比，E-cadherin表達明顯增加，Vimentin、Twist1的表達顯著下降(P<0.05)，見表2、圖4。

表2 Western印跡法檢測小檗堿和二甲雙胍對EMT相關蛋白表達的影響

圖4 Western印跡法檢測小檗堿和二甲雙胍處理后對EMT相關蛋白的表達情況

3 討 論

腫瘤獲得轉移和侵襲能力的重要標志是發生EMT。研究發現，腫瘤細胞發生EMT后，癌細胞之間的黏附性下降，發生解離，上皮細胞獲得間充質細胞的表型并由此增加遷移和侵襲的能力〔8〕。文獻報道，miRNA與多種腫瘤的發生發展及預后密切相關〔9〕。miRNA是一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA分子，并參與細胞發育、增殖、分化、凋亡等一系列重要的生物學過程〔10〕。研究發現，miRNA的表達水平對EMT發生有促進或抑制作用〔11〕。miR-212定位于染色體17p13.3上，參與多種腫瘤的生物學進展。如在胰腺癌中miR-212表達上調作為促癌基因參與腫瘤發展〔12〕；相反，miR-212在肝細胞癌中表達下調作為腫瘤抑制因子發揮作用〔13〕。本研究顯示miR-212的高表達水平能夠促進食管癌細胞的遷移和侵襲能力。因此，通過miRNA調節并干預食管癌細胞的生物學進展，找到具有治療潛力的miRNA的靶點藥物，能夠提高食管癌臨床治療手段。

前期研究顯示，給予LY294002(磷脂酰肌醇三激酶抑制劑)、雷帕霉素(靶蛋白抑制劑)等腫瘤相關經典信號通路抑制劑，不能抑制miR-212介導的促進食管癌細胞遷移的能力。因此推測，miR-212過表達能夠激活下游多條信號通路，從而促進EMT轉化過程。

小檗堿又名黃連素，具有抗炎、抗菌、抗糖尿病等〔14,15〕作用。二甲雙胍能夠抑制食管癌〔16〕、乳腺癌〔17〕等腫瘤細胞的生長，其潛在的廣譜抗腫瘤活性也被廣泛研究。腫瘤的聯合用藥是指利用不同藥物之間的協同作用以取得比單一藥物更好的效果〔18〕，通過減低藥物劑量達到減少藥物毒副作用目的，并增強藥物療效，有效抑制腫瘤生長，防止腫瘤的侵襲和轉移〔19〕。將廣譜抗腫瘤藥物小檗堿和二甲雙胍聯合用藥，能有效地提高抗腫瘤藥物的活性，達到抑制腫瘤細胞生長的目的。

本實驗表明，低劑量的小檗堿、二甲雙胍單獨處理miR-212過表達的KYSE-450細胞，未能有效抑制細胞遷移能力；將二者聯合應用后，對細胞遷移能力的抑制作用顯著增強，表明低劑量的小檗堿與二甲雙胍聯合后，對高表達miR-212的KYSE-450細胞的遷移能力具有顯著的協同抑制作用，其作用機制可能是通過抑制食管EMT及抑制轉錄因子Twist1的表達。