脅腹寧顆粒對慢性非萎縮性胃炎大鼠NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

李婷 張宇 張兆鵬 孫文靜 冷炎 劉鐵軍

(1長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肝脾胃病科，吉林 長春 130021；2長春中醫(yī)藥大學(xué))

脅腹寧顆粒是長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑，是國家級名老中醫(yī)、終身教授劉鐵軍老師的經(jīng)驗(yàn)方，臨床應(yīng)用20余載，主要用于治療脅肋部疼痛、脹滿，相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的急慢性膽囊炎。在20多年的臨床實(shí)踐中，筆者發(fā)現(xiàn)一部分患者脅肋部疼痛脹滿伴隨胃脘部脹痛，給予脅腹寧顆粒治療后，脅肋部疼痛改善的同時(shí)，胃脘部脹痛也明顯改善，且文獻(xiàn)也證實(shí)膽囊炎與胃炎有一定的相關(guān)性〔1〕。本實(shí)驗(yàn)擬探討脅腹寧顆粒對慢性非萎縮性胃炎大鼠胃黏膜病理組織學(xué)和白細(xì)胞介素(IL)-8、IL-10和核因子(NF)-κB的影響，擴(kuò)大脅腹寧顆粒治療范圍。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠40只，雌雄均等，體重(210±10)g，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。

1.2藥物和試劑 氨水，北京化工廠，批號：20171107；奧美拉唑，四川科倫藥業(yè)，批號：8171204151；脅腹寧顆粒，長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑中心，長衛(wèi)藥制字(96)1392號；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒等。

1.3儀器 電子天平，高速離心機(jī)，病理切片機(jī)，光學(xué)顯微鏡，酶標(biāo)儀，恒溫水浴箱等。

1.4造模和分組方法 將Wistar大鼠40只適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為正常組，模型組，對照組和治療組，雌雄均等，分籠飼養(yǎng)。正常組每日給予標(biāo)準(zhǔn)鼠料喂養(yǎng)，其余給予0.02%的氨水(每日現(xiàn)配，保證濃度)自由飲用，同時(shí)配合饑飽失常法(1 d禁食，2 d飽食)，控制室內(nèi)溫度24℃左右，連續(xù)造模90 d(預(yù)實(shí)驗(yàn)已證實(shí)此方法造模成功)。造模90 d后正常組和模型組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，每日給予生理鹽水灌胃；對照組給予奧美拉唑6.6 g/kg灌胃給藥，治療組給予脅腹寧顆粒5 g/kg灌胃給藥，連續(xù)治療14 d。治療過程中，模型組、對照組和治療組每日均給予0.02%的氨水自由飲用。

1.5檢測方法 連續(xù)給藥14 d后，所有大鼠禁食不禁水24 h，給予2%戊巴比妥鈉溶液(50 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，腹壁由下至上剪開，找到腹主動(dòng)脈，用1 ml注射器抽取腹主動(dòng)脈血液5 ml，離心3 000 r/min、15 min，取上清液備用。同時(shí)沿腸管找到胃組織，沿胃小彎剪開，生理鹽水沖凈，固定在泡沫浮板上，放入10%中性甲醛溶液(pH7.4)中備用。HE染色觀察胃黏膜病理變化，將胃組織酒精脫水，石蠟包埋，病理切片，蘇木精染色，伊紅染色，觀察胃黏膜組織損傷程度；ELISA法檢測血清IL-8和IL-10的含量，嚴(yán)格遵從試劑盒操作步驟，在450 nm波長用酶標(biāo)儀測各孔樣品的光密度值。蛋白印跡法檢測大鼠胃組織NF-κB的蛋白含量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠一般狀態(tài) 模型組大鼠皮毛粗糙、無光澤，精神萎靡，眼睛無神，活動(dòng)少且遲緩，進(jìn)食差，體重低，形體瘦小；治療組大鼠皮毛較光亮，精神狀態(tài)佳，眼神靈活，好動(dòng)，進(jìn)食正常、體重中等。

2.1.1肉眼觀察 模型組胃黏膜表面粗糙，皺襞存在，呈暗紅色或淡紅色，可見散在糜爛、充血、出血點(diǎn)；空白組胃黏膜表面較光滑，皺襞存在，呈淡紅色，未見充血、水腫及出血點(diǎn)；治療組胃黏膜表面較光滑，皺襞存在，呈淡紅色，個(gè)別顏色暗紅，個(gè)別可見糜爛、充血和出血點(diǎn)，較模型組輕。

2.1.2鏡下觀察 模型組胃黏膜上皮細(xì)胞排列不規(guī)則，可見大量上皮細(xì)胞脫落壞死，黏膜層有出血和糜爛，黏膜下層充血明顯，大量淋巴細(xì)胞浸潤，腺體完整；正常組胃黏膜上皮細(xì)胞排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整，未見明顯出血、糜爛及充血水腫，未見大量淋巴細(xì)胞浸潤，腺體結(jié)構(gòu)完整；治療組胃黏膜上皮排列較規(guī)則，上皮結(jié)構(gòu)相對完整，黏膜層多數(shù)無出血和糜爛，黏膜下層無充血明顯，未見大量淋巴細(xì)胞浸潤，腺體完整。見圖1。

圖1 各組胃黏膜鏡下改變(HE染色，×100)

2.2各組IL-8和IL-10及NF-κB水平比較 模型組血清IL-8、IL-10明顯高于正常組(P<0.01)。對照組IL-8、IL-10較模型組有所下降(P<0.05)。經(jīng)脅腹寧顆粒治療后，IL-8較模型組明顯下降(P<0.01)；IL-10較模型組有所下降(P<0.05)。NF-κB蛋白含量:模型組明顯高于正常組(P<0.05)；對照組較模型組有所下降(P<0.05)；給予脅腹寧顆粒治療后，治療組NF-κB含量明顯下降(P<0.05)。見表1，圖2。

表1 治療后各組IL-8、IL-10及NF-κB水平比較

與正常組相比:1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組相比:3)P<0.05，4)P<0.01

圖2 各組NF-κB蛋白表達(dá)

3 討 論

慢性淺表性胃炎屬于中醫(yī)的胃脘痛、胃痞、嘈雜、反酸等范疇，臨床癥狀反復(fù)，隨情緒、飲食、氣候等變化癥狀加重，故而尋求中醫(yī)治療的患者越來越多。脅腹寧顆粒由大黃、延胡索、川楝子、木香、郁金、白芍、白豆蔻、甘草等藥物組成，具有行氣導(dǎo)滯、通腑瀉下的作用。既往的研究證實(shí)脅腹寧顆粒具有治療膽囊炎的效果〔2～6〕。方中大黃苦寒，功能清熱瀉火，通腑瀉濁，用以導(dǎo)濕熱之邪由便而解，給邪以出路，故為君藥。延胡索、川楝子為佐藥，川楝子苦寒，功能清熱瀉火、行氣止痛，又能引濕熱下行；延胡索能活血行氣止痛，善治一身上下諸痛，二藥配伍應(yīng)用共為臣藥，佐助君藥加強(qiáng)疏肝理氣、活血止痛之功。木香調(diào)暢氣機(jī)，芳香化濕，為行氣止痛常用之品；郁金為血中之氣藥，于活血化瘀之中，兼能行氣解郁，能理氣郁而散結(jié)氣，活血瘀而除血滯，助君藥通腑氣，瀉濁毒。白芍、甘草合用為芍藥甘草湯，芍藥性酸寒，甘草性甘溫，故能酸甘化陰，調(diào)和脾胃，緩急止痛。白豆蔻具有化濕行氣、開胃消食的作用，在治療疾病的同時(shí)去除濕邪，有化濕之功。

IL-8是趨化因子家族中的細(xì)胞因子，屬于促炎因子，可以由脂多糖、單核巨噬細(xì)胞等細(xì)胞因子刺激而產(chǎn)生，主要生物活性為吸引和激活中性粒細(xì)胞，使中性粒細(xì)胞在胃黏膜聚集而損傷胃黏膜〔7,8〕，能夠激活NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。本研究結(jié)果提示脅腹寧顆粒能夠使慢性淺表性胃炎大鼠IL-8水平下降。

IL-10參與炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，IL-6、IL-8及IL-10這些細(xì)胞因子和趨化因子可引起中性粒細(xì)胞的聚集和激活，在感染、腫瘤等疾病中起到重要作用，與消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)疾病關(guān)系密切〔9,10〕，能夠激活NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。本研究結(jié)果提示脅腹寧顆粒能夠使慢性淺表性胃炎大鼠IL-10水平下降，在防治胃炎組織損傷中起著重要作用。NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路已經(jīng)被證實(shí)與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)〔11〕，參與多種炎癥反應(yīng)，在靜息狀態(tài)下以二聚體形式存在，其二聚體與其抑制因子IκB結(jié)合形成三聚體(p50/p65/IκB)存在于細(xì)胞質(zhì)中，是無活性的，當(dāng)受到外界刺激時(shí)，如腺病毒、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6、IL-8、IL-10等或物理、化學(xué)因素刺激時(shí)〔12,13〕，與其特異性跨膜受體結(jié)合，激活誘導(dǎo)性激酶NIK，NIK再激活I(lǐng)KK，IKK為IκB激酶，IKK使三聚體p50/p65/IκB的IκB發(fā)生降解，NF-κB被激活，從三聚體中釋放出來，迅速進(jìn)入到細(xì)胞核〔14〕，多在5 min內(nèi)可以達(dá)到峰值〔15〕，進(jìn)入細(xì)胞核與靶基因結(jié)合，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示慢性非萎縮性胃炎大鼠IL-8、IL-10和NF-κB水平均增高；脅腹寧顆粒治療后，IL-8、IL-10和NF-κB均下降，考慮脅腹寧顆粒治療慢性非萎縮性胃炎可能與抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。