慢性飲酒及戒斷對老年大鼠學習記憶的影響

劉國良 林玲

(河南醫學高等專科學校，河南 鄭州 450003)

由于慢性飲酒而導致酒精成癮，對身體各項功能造成嚴重危害，對神經系統的損害尤為嚴重，表現為各種認知功能障礙。研究表明〔1,2〕，酒精對神經系統損傷的機制之一是乙醇的代謝產物乙醛等具有脂溶性和水溶性雙向特征，可以通過血腦屏障，并對中樞神經遞質系統產生嚴重影響，最終導致機體出現多種神經行為改變。文獻報道，急性、慢性酒精成癮都可造成大鼠學習記憶能力下降〔3,4〕，目前關于酒精成癮機制的研究很多，包括神經遞質、受體及信號轉導通路等，但從突觸可塑性的角度進行探討相對較少。本實驗通過建立慢性酒精依賴老年大鼠及戒斷模型，并觀察酒精依賴及戒斷后老年大鼠學習記憶能力的改變及海馬突觸可塑性、突觸可塑性蛋白(PSD-95)表達的變化，探討慢性酒精依賴影響老年大鼠學習記憶損傷的可能機制。

1 材料和方法

1.1藥品和試劑 無水乙醇(鄭州中博化工有限公司)；兔抗PSD-95多克隆Ⅰ抗(Abcam公司，USA)，細胞裂解液、異硫氰基熒光素(FITC)標記的羊抗兔熒光Ⅱ抗、TritonX-100、牛血清白蛋白(BSA)等均購于碧云天生物科技有限公司，其他試劑均采用國產分析純。Morris水迷宮(北京醫學科學院藥物研究所研制)；BL-420s生物信號分析系統(成都泰盟科技有限公司)；熒光顯微鏡(OLYMPUS)，冰凍切片機(OLYMPUS)，大鼠腦立體定位儀(安徽正華生物儀器設備有限公司)。

1.2方法

1.2.1動物及分組 36只老年雄性SD大鼠(18月齡)，SPF級，體重180～220 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(湘)2011-0003。動物飼養環境：通風，自然光照，常規攝食飲水，室溫(22±1)℃，適應性飼養1 w后開始實驗。分為對照組、乙醇組和戒斷7 d組，每組12只。對照組大鼠正常飲水飼養，乙醇組大鼠參照Turchan等〔5〕的方法建立慢性酒精依賴大鼠模型：以6%(V/V)的酒精作為大鼠唯一飲水來源，持續30 d。戒斷7 d組大鼠同乙醇組飼養30 d后，恢復正常飲水7 d。每日觀察并記錄大鼠的飲水及進食量，在實驗過程中，大鼠飲水采用帶刻度的飲水瓶，日飲水量不足20 ml的大鼠予以剔除。為確保酒精濃度，每日8∶00更換由無水乙醇和雙蒸水配制的新鮮酒精溶液。 參照文獻〔6〕的方法，造模完成24 h后對乙醇組和戒斷7 d組大鼠進行柳田知司評分，在造模過程所有大鼠無死亡。

1.2.2Morris水迷宮檢測各組大鼠學習記憶能力 為盡量減少酒精戒斷癥狀對大鼠學習記憶的干擾，乙醇組大鼠在造模最后4 d(造模第27～30天)、戒斷組大鼠在酒精戒斷7 d之后進行Morris水迷宮實驗，訓練共進行4 d，每天2次，每次訓練時間間隔15 min。

1.2.3電生理實驗 水迷宮實驗結束后各組一半大鼠(6只)進行電生理實驗。

1.2.3.1動物手術 10%(V/V)水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.3～0.4 ml/100 g)，固定于立體定位儀上，暴露顱骨，參照大鼠腦解剖圖譜定位海馬CA1區(前囟向后7.5 mm，左旁4.2 mm，顱骨表面向下3.0 mm)，將記錄電極置入CA1區，參考電極E1(前囟向前2.0 mm，右旁2.0 mm，顱骨表面向下3.0 mm)植入額葉，兩者都以E2(前囟向前2.0 mm，左旁2.0 mm)為參考，牙托粉固定。術后肌注青霉素抗感染，充足食物和水分供應。

1.2.3.2誘發電位的記錄 首先記錄單個刺激〔波寬0.1 ms，強度為引起最大群體電位(PS)的50%〕誘發的PS幅值。然后用100 Hz 5 s(波寬0.1 ms)的高頻刺激(HFS)誘導海馬長時程增強(LTP)。以6個時間點的PS幅值的平均值作為自身基礎幅值，每個時間點的突觸傳遞水平以相對值(%)表示，相對值=(實測值-相對值)/相對值×100%。

1.2.4免疫熒光實驗檢測海馬CA1區和前額葉皮層PSD-95蛋白表達 將各組剩下的6只大鼠灌注后取腦，置于4% 多聚甲醛溶液中過夜，經30%蔗糖溶液脫水后，用恒溫(-20℃)冰凍切片機作冠狀切片，厚度30 μm，隔 4片取 1片腦片，切片經0.3%TritonX-100通透2 h，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗5 min/次×3 次，10%BSA封閉1 h，0.01 mol/L PBS漂洗5 min/次×3次。滴加兔PSD-95多克隆抗體(1∶500)4℃ 條件下孵育過夜； 復溫后0.01 mol/L PBS漂洗5 min/次×3次。暗室加入FITC標記的羊抗兔二抗(1∶1 000)室溫孵育2 h，0.01 mol/L PBS漂洗5 min/次×3 次，防淬滅的封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察拍片，每張切片檢測海馬CA1區和前額葉皮層平均陽性細胞數(IPP6.0軟件分析)。

1.2.5數據統計分析 應用SPSS18.0軟件進行單因素方差分析、q檢驗。

2 結 果

2.1柳田知司評分結果 乙醇組的戒斷癥狀評分〔(15.42±2.32)分〕顯著高于對照組〔(4.54±1.21)分，P<0.01〕；與乙醇組比較，戒斷7 d組戒斷癥狀評分顯著降低〔(6.06±1.31)分，P<0.01〕。

2.2各組逃避平臺潛伏期比較 第2～4天，乙醇組逃避潛伏期時間較對照組明顯延長(均P<0.05)；戒斷7 d組逃避潛伏期時間較乙醇組明顯縮短(均P<0.05)，但顯著長于對照組(均P<0.05)。見表1。

2.3各組LTP幅值增加相對值比較 與對照組相比，乙醇組LTP幅值增加相對值明顯降低(P<0.05)，戒斷7 d組LTP幅值增加相對值較乙醇組明顯升高(P<0.05)。見圖1。

表1 各組逃避平臺潛伏期時間比較

與對照組比較：1)P<0.05；與乙醇組比較：2)P<0.05；表2同

與對照組比較：1)P<0.05；與乙醇組比較：2)P<0.05圖1 各組HFS前后海馬CA1區誘發電位主波幅值的變化

2.4各組PSD-95蛋白表達比較 海馬CA1區和前額葉皮層神經元胞質內可見FITC標記的綠色熒光免疫反應陽性產物為PSD-95蛋白，對照組PSD-95陽性細胞熒光染色強，而乙醇組PSD-95陽性細胞熒光染色淺；與乙醇組比較，戒斷7 d組PSD-95陽性細胞熒光染色強(圖2，圖3)。與對照組比較，乙醇組陽性細胞數明顯減少(P<0.05)，積分光密度顯著減弱(P<0.05)，與乙醇組比較，戒斷7 d組陽性細胞數明顯增加(P<0.05)，積分光密度明顯增強(P<0.05)。見表2。

圖2 各組海馬CA1區PSD-95蛋白表達(×400)

圖3 各組前額葉皮層PSD-95蛋白表達(×400)

表2 各組前額葉皮層和海馬CAI區PSD-95免疫反應陽性細胞計數、平均積分光密度比較

3 討 論

海馬和前額葉皮層都是神經元突觸可塑性的重要區域，與學習記憶的形成密切相關。長期飲酒可導致海馬神經元的丟失，進而導致學習記憶能力減退〔7～10〕。本實驗用6%的酒精作為老年大鼠唯一的飲水來源連續飲用30 d來模擬慢性酒精依賴的大鼠模型，結果顯示，乙醇組大鼠在酒精戒斷24 h后出現明顯的戒斷癥狀：異常姿勢、高激惹性和體重減輕等，說明實驗造模成功。本實驗Morris水迷宮結果說明酒精依賴大鼠空間記憶能力明顯減退，實施酒精戒斷以后，老年大鼠的空間記憶能力得到一定的改善。

LTP是學習記憶的神經基礎，也是突觸可塑性的重要表現〔11，12〕。在本實驗中，強直性高頻刺激在3組動物海馬CA1區均可誘導出穩定的LTP樣電位變化，說明3組動物海馬神經元均具有突觸可塑性，LTP幅值升高程度說明酒精依賴對海馬神經元的損傷，使其可塑性下降。

突觸后致密物PSD是位于突觸活性區突觸后膜與胞質相連的一層致密物，是突觸可塑性的關鍵分子。研究表明，PSD-95能夠促進突觸前膜突觸素的表達增加，增強AD大鼠的空間記憶能力〔13〕。尹美芳〔14〕研究表明，PSD-95參與了長期飲酒導致海馬突觸可塑性及空間記憶能力的損傷。前額葉皮層在動物空間記憶的行程中也具有非常重要的作用〔15〕。本實驗結果說明慢性酒精依賴可使學習記憶相關遞質PSD-95的釋放減少，最終使老年大鼠的空間記憶能力減退。

本實驗從行為學、在體電生理、免疫熒光等方法證實了老年慢性飲酒導致大鼠的空間記憶能力減退，其原因可能與慢性飲酒導致老年動物海馬和前額葉皮層神經元損傷、學習記憶相關遞質的釋放減少、突觸可塑性下降有關，但其更深的作用機制還有待進一步研究。