骨髓間充質干細胞對老年大鼠髖部骨折后急性肺損傷的保護作用及機制

王海斌 石利濤

(1遵化市人民醫院骨科，河北 遵化 064200；2承德醫學院附屬醫院骨科)

髖骨骨折患者中大多數為老年患者，通常首選手術治療〔1，2〕，但預后并不理想。有報道顯示，老年髖骨骨折患者手術后死亡率高達30%〔3，4〕。調查研究表明，老年髖骨骨折術后死亡危險因素中臥床時間不是獨立危險因素，死亡的主因是骨折引起的肺部并發癥〔5〕，而目前對于這種情況缺乏有效治療手段。

骨髓間充質干細胞(BMSCs)是骨髓中具有多向分化潛力和自我更新能力的干細胞，在一定條件下可向3個胚層的細胞分化〔6〕，其多向分化潛能會促進組織再生，如肌肉、軟骨、脂肪等組織〔7〕。同時，由于BMSCs自身增殖能力強、分化廣，還具有免疫調節及修復受損組織等功能。當發生肺部炎癥時，BMSCs向肺部聚集，參與肺組織的功能修復。但是，當老年患者發生髖骨骨折并發肺損傷時，BMSCs是否也能起到相似作用尚不清楚。本研究以移植BMSCs進行干預治療，觀察髖骨骨折后急性肺損傷的病理變化，探討BMSCs治療髖骨骨折并發肺損傷的可能機制。

1 材料和方法

1.1分組和建模 45只健康雄性SD老年大鼠(10月齡)，實驗動物許可證號：SCXK(冀)2015-0100，由河北省實驗動物中心提供。本研究通過遵化市人民醫院倫理委員會審查；所有大鼠在適應性飼養7 d后用于實驗，隨機分成正常組(無任何處理)、模型組、治療組，每組15只。

建模方法：大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，打擊器上仰臥固定，左下肢置于砧板上拉直與水平面平行，標記大鼠左側大粗隆位置，然后緊貼粗隆間放置打擊器鈍骨刀，使砝碼從20 cm處落下，造成左側髖骨骨折〔8〕。檢測觸及骨擦感和骨擦音被認為造模成功。模型組建立髖骨骨折模型后尾靜脈注射1 ml生理鹽水，治療組建立髖骨骨折模型后尾靜脈注射1 ml BMSCs(2.5×106/ml)。

1.2主要試劑與儀器 倒置顯微鏡(Olympus公司)，骨折打擊器(自制)，組織勻漿機(上海天呈科技有限公司北京分公司)，切片機(德國Leica公司)；流式細胞儀(德國Partec)；PE-CD90抗體、PE-CD45抗體、FITC-CD44抗體(美國e-BIOSCIENCE)；低溫高速離心機(Eppendorf 公司)，大鼠髓過氧化物酶(MPO)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(R&D 公司)；Toll樣受體(TLR)9多克隆抗體、核因子(NF)-κB多克隆抗體(購自abcam公司)。

1.3大鼠BMSCs的分離培養 采用脫臼法處死SD大鼠(1月齡，河北省實驗動物中心提供)，離斷后肢轉移至無菌平皿中，去除附著肌肉，剪除股骨末端，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗髓腔收集骨髓。反復吹打成骨髓單細胞懸液，轉移到離心管中，離心5 min，棄上清，DMEM培養液重懸，按1×105/cm2密度接種于培養皿，置于培養箱(37℃、5% CO2)中孵育培養，每周換液3次，待細胞達到80%～90%融合時，進行消化，按1∶3比例傳代培養。

1.4BMSCs的鑒定 第三代BMSCs清洗、消化后，1 000 r/min離心5 min收集細胞，用PBS重懸，將細胞濃度調節為1×1012/L單細胞懸液；流式細胞儀進行檢測：將單細胞懸液轉移至取液管中，分別加入FITC-CD44、PE-CD90和PE-CD45一抗，充分混勻，離心3 000 r/min，37℃避光孵育，過濾后進行檢測。

1.5肺組織損傷評分 建模后24 h，每組隨機取5只大鼠，4%多聚甲醛固定24 h，梯度脫水，二甲苯透明后石蠟包埋固定，連續切片(厚度5 μm)。切片常規脫蠟、復水，行蘇木精-伊紅(HE)染色，在顯微鏡下觀察肺組織形態并拍照。對肺組織損傷進行評分，每項標準按無、輕、中、重，分別記為 0、1、2、3 分。評分標準：(1)肺不張；(2)肺泡出血；(3)肺泡水腫；(4)炎癥細胞浸潤；(5)透明膜形成；(6)肺間質水腫。高倍顯微鏡下每張切片隨機取5個視野，取平均值即得肺組織損傷評分。

1.6肺組織干濕質量比(W/D) 取大鼠右肺中葉組織稱重，然后放入60℃恒溫烤箱中3 d至恒重再稱重，兩次稱重之比為W/D值。

1.7肺組織中MPO及炎性因子TNF-α、IL-6水平 每組取5只大鼠肺組織各100 mg，研碎后4℃下加裂解緩沖液裂解1 h，離心10 min取上清液，按照ELISA 試劑盒說明步驟操作。

1.8ELISA 檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6水平 每組取5只大鼠，經腹主動脈取血5 ml，靜置，離心10 min取血清，按照ELISA 試劑盒說明步驟操作。

1.9Western印跡法檢測肺組織中TLR9、NF-κB蛋白水平 在肺組織(50 mg)中加1 ml裂解液，冰上勻漿，4℃離心10 min，經BCA法蛋白定量后上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質：制備5%濃縮膠及12%的分離膠。電泳：調解電壓至80 V，90 min后轉為100 V至溴酚藍跑至距分離膠底部0.5 cm時停止。轉膜：280 mA恒流1 h，結束后關閉電源取出聚偏氟乙烯(PVDF)膜，在麗春紅染液中浸泡10 min，如有條帶顯現說明轉膜成功，采用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液封閉1.5 h。加一抗、β-actin(1∶2 000)，4℃冰箱過夜。加二抗37℃ 2 h，結束后用TBST漂洗10 min×3次，后顯影。用 Quantity One軟件對蛋白質條帶進行分析，測定其吸光度值。目的蛋白的相對表達強度=目的蛋白的吸光度值/β-actin的吸光度值。

1.10統計學方法 采用 SPSS17.0 軟件行單因素方差分析。

2 結 果

2.1BMSCs的形態 BMSCs接種后6～8 h，懸浮的細胞開始貼壁，24 h貼壁基本完成；3 d后呈梭形或多角形；7 d后貼壁細胞達80%～90%融合，整體呈螺旋形或漩渦狀(圖1)。

2.2BMSCs表面標志物檢測 P3代大鼠BMSCs呈CD44+/CD90+/ CD45-，鑒定結果確認為BMSCs，見圖2。

2.3肺組織病理學改變 正常組管壁無增厚，肺泡結構正常，未發現炎性細胞浸潤；模型組大鼠肺泡和間質處發現大量炎癥細胞浸潤，同時肺泡間隔增厚，肺泡壁結構破壞；治療組大鼠肺泡壁結構比較完整，肺泡和間質處炎性改變減輕。見圖3。正常組肺組織損傷評分為(2.75±1.03)分，明顯低于模型組(7.42±1.55)分及治療組(5.80±1.34)分，差異均有統計學意義(均P<0.01)；治療組肺組織損傷評分也明顯低于模型組(P<0.01)。

圖2 流式細胞儀檢測BMSCs的表面標志物

圖3 各組肺組織HE染色(×100)

2.4各組肺組織W/D 模型組肺組織W/D(6.50±0.51)明顯高于正常組(3.90±0.38)和治療組(4.70±0.44，均P<0.05)，治療組W/D并未恢復到正常水平。

2.5ELISA檢測肺組織中 MPO 及TNF-α、IL-6水平 模型組肺組織中MPO及TNF-α、IL-6水平明顯高于正常組(P<0.01)，而與模型組相比，治療組肺組織中 MPO、TNF-α、IL-6水平明顯下降(P<0.01)。見表1。

表1 各組肺組織MPO、TNF-α和IL-6水平

與對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01；下表同

2.6各組血清TNF-α、IL-6水平比較 模型組血清中TNF-α、IL-6水平較正常組明顯增高，差異有統計學意義(P<0.01)，而治療組血清中TNF-α、IL-10水平較模型組明顯下降(P<0.01)，見表2。

2.7Western印跡檢測結果 模型組肺組織中TLR9(0.87±0.16)、NF-κB(1.10±0.14)蛋白表達水平較正常組(0.25±0.07，0.22±0.08)和治療組(0.58±0.14，0.65±0.16)明顯升高(P<0.01)；與正常組相比，治療組TLR9、NF-κB蛋白表達水平更高(P<0.01)。見圖4。

表2 各組血清中TNF-α、IL-6水平比較

圖4 Western印跡檢測各組肺組織中TLR9、NF-κB蛋白表達水平

3 討 論

髖骨骨折是老年患者常見的骨科疾病，也是其致殘、致死原因之一〔9〕。近年來，老齡化情況日益嚴重，老年人骨質量及強度大幅下降，易發生骨質疏松，摔倒等一些低能量損傷即可導致髖骨骨折，這對老年人生活、生存質量造成嚴重威脅〔10〕。有報道顯示，老年患者發生髖骨骨折后1年內病死率高達30%，其中許多患者不能恢復至骨折前水平〔11〕。造成死亡率高的原因目前尚不清楚，也缺乏有效治療手段〔12〕。

BMSCs是可進行體外培養的干細胞，在不同環境刺激下能參與組織再生、細胞分化〔13〕。同時，在不同周圍組織細胞和微環境的誘導下，BMSCs能參與免疫抑制過程，表達可溶性因子如趨化因子-2、白血病抑制因子等〔14，15〕。經尾靜脈注射的 BMSCs可在體內廣泛分布，但依然有傾向性，會優先向受損、發炎組織遷移。BMSCs表面的抗原并不具有特異性，因此在BMSCs上并未發現特異性標記分子〔16〕。所以，采用CD90、CD44陽性表達，CD45陰性表達來鑒定BMSCs〔17〕。本研究采用流式細胞儀檢測證明得到的細胞為BMSCs。

創傷可導致嚴重的炎癥反應，會使炎癥細胞向肺部浸潤，而肺組織中也出現大量巨噬細胞〔18〕。老年大鼠髖部骨折后，肺部管腔分泌物明顯增多，出現大量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤。經尾靜脈注射BMSCs后，肺部分泌物、炎癥細胞浸潤減少，提示BMSCs可有效緩解髖部骨折所致急性肺部損害。TNF-α是由單核巨噬細胞產生的，在機體免疫調節、抗感染等方面發揮著重要的作用〔19〕，但TNF-α表達過高則會引起休克、發熱等反應；IL-6是趨化因子家族中的細胞因子，能與其他細胞因子結合產生協同作用，參與機體發熱、炎癥反應等，是機體炎癥狀態的指標之一〔20〕。本實驗結果提示，髖部骨折會導致老年大鼠出現急性肺損傷及全身炎性反應，表現為外周血及肺內TNF-α、IL-6水平升高；BMSCs可以通過平衡炎癥反應達到減輕急性肺損傷的作用。

TLR被證實是一類識別型受體家族，在呼吸機相關性肺損傷(VALI)中起到重要作用。國外報道，在VALI研究中發現TLR家族中的TLR4和TLR9表達水平均明顯上調〔21〕。在急性肺損傷發生過程中，TLR被激活，同時活化NF-κB信號通路，而后者的活化可釋放炎性細胞因子，如IL-6和TNF-α等，促進炎癥反應進一步發展〔22〕。本實驗結果顯示，BMSCs抑制了建模后大鼠肺組織中TLR9及NF-κB蛋白表達水平，同時肺組織和血清中TNF-α、IL-6含量明顯下降，提示BMSCs減輕了建模后的肺病理性損傷程度，這與有關文獻報道基本一致〔23〕。BMSCs移植能減輕大鼠肺損傷，降低炎性因子，可能成為急性呼吸窘迫綜合征和肺損傷的潛在細胞治療方法。

綜上所述，本實驗證實了髖骨骨折能夠對肺部造成急性損傷，而通過尾靜脈途徑注射BMSCs能有效減輕骨折后急性期肺部炎癥及由此導致的肺損傷，從而為臨床應用提供理論基礎、實驗數據。