活血益心方對大鼠缺血再灌注心肌損傷的保護(hù)作用

于艷波 劉占軍 蘆珊

(1吉林大學(xué)第二臨床醫(yī)院臨床技能培訓(xùn)中心，吉林 長春 130062；2長春生物制品研究所有限責(zé)任公司；3吉林大學(xué)第二臨床醫(yī)院老年病科)

缺血性心臟病是人類最常見且危害嚴(yán)重的疾病之一，心肌缺血再灌注損傷是急性心肌梗死、冠心病等缺血性疾病常見的病理過程。目前臨床治療采用動脈搭橋、溶栓療法、冠脈介入等手段,可以使缺血心肌恢復(fù)血流供應(yīng),減少壞死和控制梗死面積進(jìn)一步擴展。多數(shù)情況下，缺血后再灌注可修復(fù)損傷組織、臟器，恢復(fù)患者生命健康，但部分患者缺血心肌在恢復(fù)血液再灌注后，會誘發(fā)一系列的功能、結(jié)構(gòu)、代謝及心肌細(xì)胞電生理特性等各個方面的損傷進(jìn)一步加重的現(xiàn)象〔1〕，不僅不能恢復(fù)組織器官功能，反而加重臟器的結(jié)構(gòu)損傷與功能障礙，即心肌缺血再灌注損傷。因此，保護(hù)缺血心肌、減少再灌注損傷顯得尤為重要。活血益心方具有活血祛瘀、宣痹止痛的功效，本研究通過對大鼠心肌缺血再灌注損傷模型的研究，進(jìn)一步觀察其對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠，體重230～250 g，購自長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK-(吉)2016-0004。

1.2藥物與試劑 活血益心方,吉林中醫(yī)藥大學(xué)制劑室制備提供,批號：20160325；丹蔞片，吉林康乃爾藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：20160307；烏來糖，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：T20160310；丙二醛(MDA，批號：20161029)、超氧化物歧化酶(SOD，批號：20161026)、游離脂肪酸(FFA，批號：20161031)、一氧化氮(NO，20161011)測定試劑盒，均為南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST，批號：160961)、乳酸脫氫酶(LDH，批號：160430)、肌酸激酶(CK，批號：160901)測定試劑盒，均為中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)；谷光甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、三磷酸腺苷酶(ATP，包括Ca2+-Mg2+-ATP、 Na+-K+-ATP)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、內(nèi)皮素(ET)、白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6測定試劑盒，批號：E20160901A，均為美國RB公司產(chǎn)品。

1.3儀器 PowerLab/8sp型多導(dǎo)生理記錄儀，澳大利亞；HX-100E型小動物呼吸機，成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)；GF-D800型半自動生化分析儀，山東高密彩虹分析儀器有限公司生產(chǎn)；ST-360型酶標(biāo)儀，上海科華實驗系統(tǒng)有限公司生產(chǎn)。

1.4方法

1.4.1分組及給藥 雄性Wistar大鼠60只(每組10只)，按體重隨機分為正常對照組，模型組，丹蔞片組(964 mg/kg)，活血益心方高(12.0 g生藥/kg)、中(6.0 g生藥/kg)和低劑量(3.0 g生藥/kg)組。每天分別灌胃給藥1次，對照組和模型組灌胃給予相同體積的蒸餾水，各組動物灌胃容積均為10 ml/kg，連續(xù)給藥10 d。

1.4.2模型制備 末次給藥(給藥第10天)1 h后，腹腔注射(ip)以生理鹽水配制的1.2 g/kg、10 ml/kg烏來糖溶液將動物麻醉，剝離氣管，連接小動物呼吸機，并于左側(cè)第3、4根肋骨處開胸，待呼吸穩(wěn)定后，用拉鉤將肋骨拉開，暴露心臟，用4號手術(shù)線結(jié)扎左冠狀動脈前降支(左心耳下1 mm處)，后迅速將心臟輕推回胸腔，在結(jié)扎時結(jié)扎扣底墊1 cm長硅膠管(輸液器前段硅膠管1 cm)，結(jié)扎30 min后剪開結(jié)扎點〔2〕，進(jìn)行再灌注，觀察120 min。記錄正常、開胸后、結(jié)扎后、再灌注120 min心電圖；空白對照組只穿線不結(jié)扎。

1.4.3觀察指標(biāo) 試驗結(jié)束腹主動脈采血，離心分離血清，檢測血清CK、LDH、AST、MDA、SOD、GSH-PX、FFA、NO、ET、IL-1、IL-6、TNF-α、CRP活性或含量；取心肌，檢測Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP含量。同時每只動物取心臟同一部位，以10%甲醛固定，HE染色，做病理組織學(xué)檢查。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件行單因素方差分析及LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1對缺血再灌注損傷模型大鼠血中心肌酶的影響 與對照組相比，模型組血中心肌酶活性異常增高(P<0.01，P<0.001)，而活血益心方高劑量組能明顯降低CK、LDH、AST酶活性(P<0.05)；丹蔞片可明顯降低CK、LDH酶活性(P<0.05)。見表1。

2.2對缺血再灌注損傷模型大鼠血中自由基的影響 與對照組相比，模型組血中SOD、GSH-PX活性明顯降低、MDA含量異常增高(P<0.05，P<0.001)，而給予活血益心方和丹蔞片后，可明顯糾正這種異常變化。活血益心方各劑量組均能明顯增強SOD活性(P<0.01，P<0.001)；活血益心方高劑量組、丹蔞片組明顯降低MDA含量(均P<0.05)；活血益心方高劑量組、丹蔞片組能明顯增強GSH-PX活性(P<0.01，P<0.05)。見表1。

表1 活血益心方對缺血再灌注損傷模型大鼠血清CK、LDH、AST活性及自由基的影響

與對照組比較：1)P<0.01，2)P<0.001，3)P<0.05；與模型組比較：4)P<0.05,5)P<0.01,6)P<0.001，下表同

2.3對缺血再灌注損傷模型大鼠心肌及血中能量代謝的影響 與模型組比較，丹蔞片組、活血益心方高、中劑量組能明顯增強心肌Ca2+-Mg2+-ATP活力(P<0.001,P<0.01,P<0.05)，活血益心方高劑量組及丹蔞片組可明顯增強心肌Na+-K+-ATP活力(P<0.01，P<0.05)；活血益心方各劑量組可明顯降低血中FFA含量(均P<0.01)；丹蔞片組對血中FFA含量無明顯影響(P>0.05)。見表2。

表2 活血益心方對缺血再灌注損傷大鼠心肌Ca2+-Mg2+-ATP、Na+-K+-ATP活力及FFA含量的影響

2.4對缺血再灌注損傷模型大鼠血中血管影響因子的影響 與對照組相比，模型組血中ET含量明顯升高(P<0.01)，NO含量明顯降低(P<0.001)，而活血益心方中、高劑量組和丹蔞片組均能明顯降低血中ET含量(P<0.01、P<0.05)；活血益心方低、中、高劑量組和丹蔞片組均能明顯增加血中NO含量(P<0.01、P<0.05)。見表2。

2.5對缺血再灌注損傷模型大鼠血中炎癥因子的影響 與對照組相比，模型組血中炎癥因子發(fā)生異常改變(P<0.05、P<0.01)，而活血益心方高劑量組、丹蔞片組均能明顯降低血中炎性遞質(zhì)IL-1含量(P<0.05，P<0.01)；活血益心方各劑量組和丹蔞片均能明顯降低血中CRP、IL-6、TNF-α含量(P<0.001，P<0.01，P<0.05)。見表3。

表3 活血益心方對缺血再灌注損傷模型大鼠血清CRP、IL-1、IL-6、TNF-α含量的影響

2.6對缺血再灌注損傷模型大鼠心肌病理的影響 通過病理組織形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果顯示模型組與對照組比較，可見心肌細(xì)胞變性，心肌纖維斷裂，心肌細(xì)胞間隙明顯增寬，炎細(xì)胞浸潤，而給予活血益心方及丹蔞片后，心肌細(xì)胞變性及炎細(xì)胞浸潤不同程度減輕，心肌損傷得到明顯改善。見圖1。

圖1 各組心肌組織病理觀察(HE，×400)

3 討 論

心肌缺血/再灌注損傷是急性心肌梗死、冠心病等缺血性疾病常見的病理過程，其機制與氧自由基的生成、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、炎癥因子釋放等因素有關(guān)〔3〕，嚴(yán)重威脅著人類的身心健康。心肌缺血后,心肌細(xì)胞從可逆性損傷到不可逆性損傷之間有一個演變過程,這與心肌缺血程度有關(guān)，在一定時間內(nèi),缺血心肌的損傷是可逆的。雖然早期、及時再灌注心臟是防止心肌組織缺血造成進(jìn)一步損害的有效方法，但缺血組織恢復(fù)血流灌注時，往往導(dǎo)致再灌注區(qū)域心肌細(xì)胞及局部血管顯著的病理變化，而這些改變的共同作用可導(dǎo)致進(jìn)一步的組織損傷。近年來中藥治療心肌缺血取得了一定的進(jìn)展，其特點為療效高、毒副作用小，在臨床應(yīng)用中起著重要作用。活血益心方是以中醫(yī)臨床實踐為基礎(chǔ)研制出的中藥復(fù)方制劑，對痰瘀互阻所致的冠心病、心絞痛具有很好的療效。本研究采用缺血再灌注心肌損傷模型，觀察活血益心方對缺血再灌注心肌損傷的保護(hù)作用。

心肌缺血再灌注損傷的機制較復(fù)雜，可造成心臟形態(tài)及功能方面的改變，因此，可通過心電圖、組織學(xué)和生化酶學(xué)等多項指標(biāo)的檢測進(jìn)行綜合判定分析〔4〕。心肌酶的釋放量是心肌損害程度的一個主要標(biāo)志，在一定程度上反映心肌病變程度。正常情況下心肌酶存在于心肌細(xì)胞的胞質(zhì)中，在維持心肌正常生理功能方面發(fā)揮著重要作用，當(dāng)心肌發(fā)生缺血、梗死或再灌損傷時，心肌受損導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重，甚至壞死、破裂，使細(xì)胞膜的通透性升高，大量的CK、LDH等被心肌細(xì)胞釋放到血中，使血液中的酶含量顯著升高，活性急劇增強，進(jìn)而加重對心肌的損傷〔5,6〕。而活血益心方能明顯抑制再灌注損傷動物血清CK、AST及LDH活性，表明活血益心方對心肌缺血再灌注損傷具有明顯保護(hù)作用。

當(dāng)發(fā)生心肌缺血再灌注時，不僅氧自由基生成增多，而且機體對自由基的清除能力減低，從而造成氧自由基大量蓄積，引起心肌組織的嚴(yán)重?fù)p傷。MDA是自由基與細(xì)胞膜上多不飽和脂肪酸反應(yīng)生成的脂質(zhì)過氧化物，可反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化情況，間接地反映自由基攻擊的嚴(yán)重程度,其含量高低反映了氧自由基在細(xì)胞內(nèi)的生成水平及其對細(xì)胞的損傷程度；SOD是體內(nèi)清除自由基的主要成分，其活力可反映機體清除氧自由基的能力；GSH-PX是機體的內(nèi)源性抗氧化物酶，反映機體的抗氧化能力。因此可以通過MDA含量及SOD、GSH-PX活性變化評定心肌缺血的程度及藥物作用機制〔7〕，試驗結(jié)果表明，活血益心方可以明顯降低血清MDA含量，顯著升高血清SOD、GSH-PX酶活性，說明活血益心方可以通過降低血清MDA含量，增強SOD、GSH-PX活性，使自由基代謝紊亂情況得以糾正，從而維持機體氧化及抗氧化系統(tǒng)的動態(tài)平衡, 減少自由基的毒副作用, 進(jìn)而降低對心肌的損傷來保護(hù)心肌。

研究表明，在心肌缺血再灌注過程中，炎癥因子貫穿于心肌損傷的全過程，隨著再灌注的進(jìn)行，大量活化的中性粒細(xì)胞聚集在心肌微血管并浸潤到心肌組織中，通過釋放細(xì)胞炎性物質(zhì)引起心肌損傷，IL-1、IL-6和TNF-α、CRP作為重要的炎癥細(xì)胞因子在缺血再灌注損傷中被廣泛地關(guān)注。心肌細(xì)胞在缺血再灌注的刺激下可合成和分泌大量 TNF-α，TNF-α能誘發(fā)炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)白細(xì)胞聚集，促進(jìn)IL-1、IL-6等炎癥介質(zhì)產(chǎn)生和釋放〔4，8，9〕；炎癥細(xì)胞含有CRP受體，感染和創(chuàng)傷等應(yīng)激反應(yīng)時，血清CRP含量迅速升高，CRP的大量產(chǎn)生并活化炎癥細(xì)胞，進(jìn)而誘導(dǎo)炎性反應(yīng)發(fā)生，通過直接(浸潤、聚集)或間接(產(chǎn)生細(xì)胞因子)作用，引起血管內(nèi)皮受損，使炎癥反應(yīng)進(jìn)一步增強，促進(jìn)了心肌缺血再灌注損傷〔10〕。本研究表明，活血益心方可以抑制心肌缺血再灌注時炎性遞質(zhì)激活，從而保護(hù)心肌缺血再灌注損傷。

NO是血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的最重要的舒血管因子，具有舒張血管、抑制血小板凝聚、減輕炎癥反應(yīng)等保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用〔11〕。ET是一種血管活性肽，具有強烈、持久的縮血管作用和促神經(jīng)內(nèi)分泌的作用。正常情況下，ET和NO處于動態(tài)平衡之中，對血管彈性進(jìn)行動態(tài)調(diào)節(jié)，維持冠狀動脈各分支血管的舒縮功能。再灌注損傷時，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損導(dǎo)致內(nèi)源性NO合成減少,使NO功能降低失活，NO和ET間平衡失調(diào)，導(dǎo)致血管舒縮功能紊亂及通透性改變，加劇心肌損傷。因此，糾正NO、ET的失衡對缺血心肌組織的保護(hù)將起積極的作用。活血益心方能明顯升高心肌再灌注損傷大鼠血清NO含量，顯著降低ET含量，表明活血益心方具有調(diào)節(jié)血管活性物質(zhì)NO、ET的分泌的功能，從而達(dá)到拮抗心肌缺血再灌注損傷、對心肌損傷起到保護(hù)作用。

心肌缺血后再灌注易導(dǎo)致心肌發(fā)生嚴(yán)重的功能紊亂，其中鈣超載是重要的機制之一。ATP酶在心肌維持生理功能中發(fā)揮著極其重要的作用, 是心肌細(xì)胞活動的物質(zhì)基礎(chǔ)。心肌缺血再灌注發(fā)生時,心肌細(xì)胞內(nèi)能量代謝出現(xiàn)障礙，ATP合成量明顯下降，ATP酶(包括Ca2+-Mg2+-ATP 酶、Na+-K+-ATP 酶等)活性隨之下降〔6〕，這兩種酶活性發(fā)生改變，必將引起胞質(zhì)內(nèi)Ca2+水平失調(diào)，從而產(chǎn)生各種病理變化，進(jìn)一步導(dǎo)致心肌細(xì)胞鈣超載和能量代謝障礙。活血益心方可有效地促進(jìn)Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性的恢復(fù)，抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，從而降低缺血再灌注損傷的程度。

心肌梗死時，F(xiàn)FA水平增高，隨著心肌利用脂肪酸供能增加，脂質(zhì)中間代謝產(chǎn)物大量堆積，過多活性氧產(chǎn)生，損害線粒體，從而引起心臟收縮、舒張功能異常，增加心肌耗氧量，而加重心肌缺血，擴大缺血或梗死范圍，加重心肌的缺血損傷壞死,促進(jìn)心律失常發(fā)生，甚至猝死〔12〕。本實驗結(jié)果表明，心肌缺血再灌后，F(xiàn)FA水平急劇升高，而活血益心方可明顯抑制FFA水平升高，從而保護(hù)心肌。綜上所述，活血益心方能有效減輕心肌病變程度，改善心肌酶活性和能量代謝，對抗自由基損傷，激活血管活性物質(zhì)，抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生，保護(hù)和穩(wěn)定心肌細(xì)胞，對缺血再灌注損傷心肌具有一定的保護(hù)作用。