ROR2在中老年宮頸癌中表達和意義及對宮頸癌細胞增殖的影響

劉春靜 陳雋 李麗萍 陸相輝

(齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

宮頸癌是中老年女性常見惡性腫瘤之一，且中老年宮頸癌患者并發癥較多，預后差，針對中老年宮頸癌患者探尋新的治療方法有重要意義〔1〕。人受體酪氨酸激酶樣單受體(ROR)2已經證實在多種腫瘤中過表達，并且與患者預后密切相關〔2，3〕。本研究旨在進一步探索ROR2在中老年宮頸癌患者中的表達及其生物學功能和相關分子機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院2012年4月至2016年9月收治的中老年宮頸癌患者80例，收集腫瘤切除后的癌組織和癌旁組織(癌周2 cm)。納入標準：年齡≥50歲；腫瘤原發于宮頸；均經活組織檢查或手術，有明確病理學診斷，符合國際婦產科聯盟(FIGO)分期；所有患者術前無輸血史，未進行過放化療。排除標準：合并其他惡性腫瘤，合并嚴重心肝腎等重要臟器功能障礙患者；合并其他較為嚴重的婦科疾病者；認知障礙及精神病患者；無完整的臨床及隨訪資料患者。患者平均年齡(70.3±5.71)歲；腫瘤病理類型：鱗癌(60例)，腺癌(20例)；腫瘤大小：<4 cm(29例)，≥4 cm(51例)；淋巴結轉移：無(36例)，有(44例)；絕經后激素調節：無(34例)，有(46例)；FIGO分期：Ⅰ期(48例)，二期(32例)；病程：3～15個月。研究獲得病人及家屬的同意并遵循醫學倫理委員會的規定。

1.2主要試劑和儀器 ROR2(貨號：ab190145)，增殖細胞核抗原(PCNA，貨號：ab152112)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體均購于美國abcam公司，二抗購于美國CST公司。轉染用lipo2000試劑購自Invitrogen。CCK-8試劑盒購于碧云天生物公司。其他試驗材料由本實驗室提供。Western印跡和凝膠成像系統購買于北京六一生物公司，酶標儀購于芬蘭雷勃公司。ROR2的小干擾(si)RNA和對照RNA由上海吉瑪制藥公司合成，序列如下ROR2 siRNA1：5′-GUCAUCGCUUGCCUGUUC-3′；ROR2 siRNA2：5′-ACCAACCCUUGAGCAUGA-3；Control siRNA：5′-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。

1.3實時定量PCR 應用高純總RNA 快速提取試劑盒提取癌組織和癌旁組織中的總RNA，將提取的RNA樣本進行反轉錄獲得對應的cDNA。然后進行實時熒光定量分析，所用引物序列如下：ROR2正義鏈5′-CCACTGGGGTTCTATATGTGCG-3′，反義鏈5′-AAATAGTCCGGTTCCCAATGAAG-3′；GAPFH正義鏈5′-ACCCCAGCAAGGACACTGAGCAAG-3′；反義鏈5′-GGCCCCTCCTGTTATTATGGGGGT-3′。反應體系總體積20 μl，包含1 μl cDNA模版，各0.5 μl 的上下游引物，10 μl SYBR GREEN master mix，其余用雙蒸水補齊。反應條件：95℃ 10 s；40個循環：95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s；4℃ 5 min。ROR2的相對表達計算通過2-△△CT方法。

1.4免疫組化 切片常規脫蠟(依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精中)，脫蠟后加入3%過氧化氫(H2O2)浸泡10 min后磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡5 min/次，3次。加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中，中火蒸煮 5 min，冷卻至室溫，反復蒸煮3次。冷卻，倒掉檸檬酸溶液，PBS洗3次，每次5 min。擦干組織周圍的 PBS 液，加山羊血清工作液放置37℃孵箱溫育30 min后傾去。小心擦干載玻片上組織周圍的血清，滴加鼠抗人的ROR2一抗(1∶100)4℃孵育過夜。PBS沖洗3次，每次5 min，山羊抗鼠的二抗37℃孵育30 min。 PBS清洗后滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15 min，PBS沖洗5 min，洗3次，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。

1.5結果判斷 染色強度判定：染色強度分為0，1，2，3分，依次為：無染色，弱染色，中等強度染色，強染色。陽性細胞率判定：0為<5%；1為5%～24%；2為25%～49%；3為50%～74%；4為≥75%。計算染色強度和陽性細胞率的總評分，0～2分判定ROR2表達為陰性，3～7分判定ROR2表達為陽性。兩名高年資病理科醫生雙盲法讀片。

1.6細胞培養和轉染 人鱗狀子宮頸癌細胞(SiHa)購自美國ATCC，在本實驗室凍存和傳代。細胞系在含有10%血清的DMEM培養基中培養。培養基加入青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 μg/ml)，細胞被放置在含5% CO2，37℃培養箱中培養。SiHa細胞復蘇培養傳代2次后，待細胞融合度達到 80%～90%時，對細胞進行轉染。按照脂質體(lipo 2000)轉染試劑操作說明，轉染SiHa細胞。細胞分為4組：Mock組(不作任何處理)、siRNA 對照(siCtrl)組和 ROR2-siRNA1轉染(SiRNA1)組，ROR2-siRNA2轉染(siRNA2)組。

1.7細胞活力檢測 使用CCK-8試劑盒進行細胞活力檢測。轉染后宮頸癌細胞消化計數以1 000個/100 μl每孔接種于96孔板內，每組設置5個復孔。將細胞放入培養箱中培養，分別在0 h，12 h，24 h，48 h，72 h取出待測96孔板加入CCK-8試劑，10 μl/孔，加入過程避免產生氣泡，37℃下孵育3 h，酶標儀吸光度設置為450 nm，檢測各組細胞的OD值。

1.8Western印跡檢測分析 棄去細胞培養基，PBS清洗3遍，消化，終止離心收集細胞沉淀，放置冰上，加入適量裂解液裂解30 min，樣本在4℃，12 000 r/min條件下離心30 min。收集上清，用二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白定量。等量的含結合緩沖液的蛋白樣品在金屬浴中100℃煮10 min。將冷卻的蛋白樣本在10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，轉膜，5%脫脂牛奶中封閉1 h，鼠抗人的ROR2(1∶1 000)、兔抗人的PCNA(1∶1 000)和GAPGH(1∶5 000)一抗孵育過夜，用PBS清洗聚偏氟乙烯(PVDF)膜3次，每次10 min，孵山羊抗鼠或兔的二抗(1∶5 000)室溫1 h，PBS洗膜，曝光，記錄結果并對蛋白進行光密度分析。

1.9統計學方法 應用SPSS18.0軟件進行配對t檢驗、χ2檢驗、Pearson相關分析、方差分析。

2 結 果

2.1ROR2在宮頸癌組織中的表達 宮頸癌組織中ROR2表達顯著高于癌旁組織〔(0.955±0.019)vs (0.602±0.108),P<0.001〕。絕經后激素調節、腫瘤大小為ROR2表達的顯著影響因素(P<0.01)；ROR2表達與淋巴結轉移和FIGO分期無顯著相關性(P>0.05)，見表1。

表1 ROR2表達與臨床病理因子相關性(n)

2.2沉默ROR2對細胞增殖的影響 Mock組、Sictrl組、SiRNA1組、SiRNA2組ROR2蛋白表達分別為：35 117.3±120.55、24 736.9±111.58、6 495.6±33.99、9 743.0±52.39。在SiHa細胞中轉染兩對ROR2 siRNA后ROR2的表達明顯受到抑制(P<0.001)。見圖1。兩對ROR2 siRNA均明顯抑制了SiHa細胞的增殖能力(P<0.001)。見圖2。

圖1 Western印跡檢測各組ROR2蛋白表達

1)P<0.001圖2 SiHa細胞轉染ROR2 siRNA后對細胞增殖能力的影響

2.3沉默ROR2對增殖蛋白PCNA的影響 Mock組、Sictrl組、SiRNA1組、SiRNA2組PCNA蛋白表達分別為：0.987±0.116、1.089±0.185、0.279±0.117、0.107±0.095。兩對ROR2小干擾RNA均明顯的抑制了SiHa細胞中PCNA蛋白的表達(P<0.001)。見圖3。

圖3 Western印跡檢測各組PCNA蛋白表達

3 討 論

宮頸癌傳統的治療手段以手術治療和放化療為主，但其預后遠未達到令人滿意的程度。隨著人類對生命科學的深入了解和科學技術的進步，基因治療已經成為宮頸癌治療的一種新模式，而篩選理想的靶基因是正在研究的熱點。

多種酪氨酸激酶已經證實在細胞增殖、極化、遷移、代謝等生物過程發揮重要作用，而它們的異常活化會導致細胞增殖調節發生紊亂，致使腫瘤發生。ROR2屬于受體酪氨酸激酶超家族，已經證實在多種惡性腫瘤中表達明顯上調，并且ROR2的高表達與這些患者的預后差密切相關，例如結直腸癌〔4〕，非小細胞肺癌〔5〕，胰腺導管腺癌〔6〕，胃腸道基質腫瘤〔7〕，骨肉瘤〔8〕，宮頸癌〔3〕。本研究結果表明ROR2在老年宮頸癌組織中高表達，與ROR2在宮頸癌中的表達結果報道一致〔3〕，且與分化程度和腫瘤大小明顯相關，提示ROR2在老年宮頸癌發生發展中可能扮演重要角色。

ROR2的生物學功能也在多種腫瘤中被廣泛研究〔2〕，例如：下調ROR2的表達后可以抑制卵巢癌細胞的侵襲和黏附〔9〕；相反，過表達ROR2可以促骨肉瘤細胞的生長〔10〕。然而，ROR2的表達是否會影響宮頸癌的生物進程至今沒有報道。腫瘤的一大特點就是調控細胞生長的基因異常表達，導致腫瘤細胞不可控制的生長。為排除脫靶效應，設計了兩對ROR2的siRNA，并通過Western印跡檢測兩對ROR2 siRNA的干擾效率，發現沉默ROR2后，宮頸癌細胞SiHa的增殖明顯受到了抑制，與ROR2在其他腫瘤細胞研究結果一致。PCNA是真核生物復制復合體的核心成分，已報道PCNA可以參與DNA損傷修復、細胞凋亡等許多重要的細胞事件，另外作為細胞增殖的指標〔11〕。本研究發現ROR2被沉默后，PCNA的表達明顯被抑制，提示ROR2可能通過調控PCNA表達影響宮頸癌細胞增殖。