痰熱清注射液輔助化療對Lewis肺癌模型小鼠免疫功能及血管內皮生長因子、血管抑素、內皮抑素水平的影響

任威 李娟

(湖北省腫瘤醫院藥學部，湖北 武漢 430079)

化療是治療肺癌的主要措施之一，然而化療藥品毒性強，甚至降低患者的免疫功能，因此，選擇一種療效顯著、安全性高的化療藥物尤為重要〔1，2〕。痰熱清注射液是一種中成藥，成分包括金銀花、黃芩及熊膽粉，對于各類感染性疾病有顯著治療效果〔3〕。血管內皮生長因子(VEGF)、血管抑素(AS)、內皮抑素(ES)均為外周血管生成調節因子，主要通過抑制腫瘤血管內皮細胞增殖達到抗腫瘤目的〔4〕。本次研究進一步分析痰熱清注射液輔助化療對Lewis肺癌模型小鼠免疫功能和VEGF、AS、ES水平的影響。

1 材料和方法

1.1材料 86只4～6周齡小鼠，購自武漢大學實驗動物中心，體重18～22 g，平均(20.31±0.72)g。Lewis肺癌瘤株購自上海信裕生物科技有限公司。DW-86L626型低溫冰箱購于四川蜀科儀器有限公司，LD-5M立式低速冷凍離心機購于青島海爾股份有限公司，精密移液器購于端士Socorex 公司，BIO-RAD酶標儀購于美國 BIO-RAD伯樂公司。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(Andy-gene公司提供)，包括小鼠外周血VEGF試劑盒(批號：HTAC017)、AS試劑盒(批號：HTAC011)、ES試劑盒(批號：HTAC023)、γ干擾素(IFN-γ)試劑盒(批號：HTAC015)、白細胞介素(IL)-2試劑盒(批號：HTAC012)、腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒(批號：HTAC009)。

1.2分組及接種方法 選取6只小鼠作為備用，其余80只小鼠隨機分為對照組、順鉑組、痰熱清組及聯合組，每組20只。除對照組外，其他3組均行Lewis肺癌瘤株接種處理：應用37℃的溫水對Lewis肺癌瘤株進行復蘇處理，并調整瘤株密度至1×107/ml。選擇2只備用小鼠，定位其右腋，分別皮下接種0.1 ml瘤株，11 d后以脫頸法處死小鼠，選擇生長狀態較好的癌組織進行洗凈處理，剪碎、研磨，提取細胞。再選2只備用小鼠進行第二輪接種。重復上述操作至第三輪接種后，將最后提取的腫瘤細胞分別接種于順鉑組、痰熱清組與聯合組小鼠的右腋皮下。

1.3治療方法 接種后1 d，對照組注射1.5 mg/kg的生理鹽水，隔天1次；順鉑組注射1.5 mg/kg順鉑(德州德藥制藥有限公司，國藥準字H20023236)，隔天1次；痰熱清組經腹腔注射痰熱清注射液(上海凱寶藥業股份有限公司，國藥準字Z20030054)，劑量為3.5 ml/kg，隔天1次；聯合組注射1.5 mg/kg順鉑+3.5 ml/kg痰熱清注射液，隔天1次。4組均持續注射2 w。

1.4指標觀察 (1)順鉑組、痰熱清組及聯合組小鼠接種5、10、14 d時的腫瘤體積。應用動物腫瘤測量跟蹤系統，電子數顯卡尺測量腫瘤最長、最短徑，腫瘤體積=腫瘤最長徑×最短徑×最短徑/2〔5〕。(2)4組小鼠接種14 d后的免疫指標水平。以免疫透射比濁法檢測小鼠外周血中免疫球蛋白(Ig)G、補體C3水平，取外周血離心分離血清，通過標準品制作標準曲線，并在波長340 nm處檢測血清IgG、補體C3水平，操作按試劑盒說明書進行。(3)4組的炎性因子(IL-2、TNF-α、IFN-γ)及血清VEGF、AS、ES水平。取4組小鼠適量股動脈血后靜置30 min，4 000 r/min離心15 min，取上層血清并保存于DW-86L626型低溫冰箱中備用。應用酶標儀并以ELISA法及其配套試劑盒檢測VEGF、AS、ES、IL-2、TNF-α、IFN-γ等水平，嚴格依據試劑盒說明書操作。

1.5統計處理 采用SPSS20.0軟件，兩兩比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1順鉑組、痰熱清組及聯合組小鼠接種后5、10、14 d時的腫瘤體積 接種后5 d，3組腫瘤體積無明顯差異(P>0.05)；接種后10、14 d，3組腫瘤體積差異有統計學意義(P<0.05)，且聯合組腫瘤體積明顯小于順鉑組及痰熱清組(P<0.05)，見表1。

表1 順鉑組、痰熱清組及聯合組接種不同時間的腫瘤體積比較

與順鉑組比較：1)P<0.05；與痰熱清組比較：2)P<0.05；與本組接種后5 d比較：3)P<0.05；與本組接種后10 d比較：4)P<0.05

2.24組免疫指標比較 4組IgG與C3水平整體比較差異有統計學意義(P<0.05)。痰熱清組IgG與C3水平與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；順鉑組、聯合組IgG與C3水平明顯低于對照組(P<0.05)，且聯合組的IgG與C3水平均明顯低于痰熱清組、高于順鉑組(P<0.05)。見表2。

表2 4組免疫指標水平比較

與對照組比較:1)P<0.05；與順鉑組比較:2)P<0.05;與痰熱清組比較:3)P<0.05；下表同

2.34組炎性因子水平比較 4組IL-2、TNF-α及IFN-γ水平整體比較差異有統計學意義(P<0.05)；順鉑組、痰熱清組、聯合組的IL-2和IFN-γ水平均明顯低于對照組，TNF-α水平明顯高于對照組(P<0.05)；痰熱清組IL-2、IFN-γ水平明顯高于順鉑組，TNF-α水平明顯低于順鉑組(P<0.05)。聯合組的IL-2水平明顯高于順鉑組，TNF-α水平明顯高于痰熱清組，IFN-γ水平明顯低于痰熱清組(P<0.05)，見表3。

表3 4組炎性因子水平比較

2.44組VEGF、ES及AS水平比較 4組間VEGF、ES及AS水平整體比較差異有統計學意義(P<0.05)；順鉑組、痰熱清組、聯合組的ES、AS水平明顯低于對照組，VEGF水平明顯高于對照組(P<0.05)；聯合組、痰熱清組VEGF水平明顯低于順鉑組，ES水平明顯高于順鉑組(P<0.05)；痰熱清組AS水平明顯高于順鉑組(P<0.05)；聯合組ES、AS水平明顯低于痰熱清組，VEGF水平明顯高于痰熱清組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 4組VEGF、ES及AS水平比較

3 討 論

肺癌是一種常見的惡性腫瘤，發病早期無顯著癥狀，難以及時發現。多數患者就診時已進入中晚期，根治性治療難度較大，可經化療延長患者的生存時間及提高生存質量〔6，7〕。但是，在患者化療治療期間，機體免疫能力會受化療藥物的影響。為了提升化療效果并且降低化療藥物對正常細胞、免疫能力的影響，臨床中常在化療期間采用中藥制劑輔助治療，痰熱清注射液即為其中較常用的一種。痰熱清注射液屬于中藥復方制劑，生物調節性較好，目前已在惡性腫瘤治療中獲得廣泛使用〔8〕。

本研究結果顯示，痰熱清注射液輔助化療能更有效降低小鼠腫瘤體積，提示痰熱清注射液輔助化療能增強化療的效果。痰熱清注射液主要由黃芩、山羊角、熊膽粉、連翹、金銀花等五味清熱的中藥組成，其中黃芩為君藥，具有清熱解毒、止咳潤肺的功效；山羊角和熊膽粉為臣藥，起到化痰止咳、解痙熄風的作用；連翹、金銀花為佐藥，起到清熱解毒的作用〔9〕。痰熱清注射液可有效緩解肺癌小鼠咳嗽、咯痰等癥狀，聯合常規化療藥物順鉑可更好地改善小鼠的治療效果，進而更有效地縮小腫瘤體積。本研究還顯示，使用順鉑進行化療后，小鼠的免疫功能會受到一定的影響，而采用痰熱清注射液輔助化療可以減輕順鉑對小鼠免疫功能造成的影響。已有動物實驗證明，化療會導致小鼠的胸腺指數、白細胞數、淋巴細胞數、單根股骨骨髓細胞數降低，而痰熱清注射液輔助化療可明顯減輕這種現象，逆轉化療對小鼠免疫功能的影響〔10，11〕，這與本研究得到的結論相似，然而其具體的作用機制還有待進一步研究。肺癌小鼠體內的巨噬細胞、活化T細胞會分泌大量IFN-γ，在抗腫瘤免疫過程中發揮重要的作用；TNF-α由巨噬細胞與活化T細胞分泌，參與炎癥反應和免疫調節過程；IL-2對細胞因子、干擾素成分可發揮誘導作用，對免疫調節有重要的作用，促進Fas抗原表達，進而促進細胞凋亡。本研究結果還顯示，順鉑可降低小鼠體內IL-2和IFN-γ水平，增加TNF-α水平，而痰熱清注射液輔助化療可緩解IL-2和IFN-γ降低及TNF-α升高的程度，從而增強其淋巴細胞的抗腫瘤免疫活性，在有效緩解炎性反應的同時改善其免疫狀態〔12〕。VEGF是一種促進外周血管生成的因子，主要通過影響血管內皮細胞PI3K起到調控的作用〔13〕；AS和ES是重要的血管生成抑制因子，其中AS通過抑制腫瘤血管的內皮細胞增殖和遷移達到抑制血管生成的目的，而ES可以對新腫瘤血管的生成造成干擾。本研究顯示，順鉑化療后ES、AS水平降低，VEGF水平升高，而采用痰熱清注射液輔助化療可抑制這種趨勢，進而抑制新生血管生成，避免腫瘤快速生長。

綜上所述，痰熱清注射液輔助化療可有效降低Lewis肺癌小鼠的腫瘤體積、增強免疫功能，可能是通過調節IL-2、TNF-α及IFN-γ等細胞因子的水平來調節小鼠的免疫功能，通過抑制新生血管生長來縮小腫瘤體積，然而其具體的作用機制還有待更為深入的研究。