NG108-15細胞系作為小鼠神經內分泌細胞模型的適合性

夏九成 龍廷 秦達念

(1攀枝花學院生物與化學工程學院，四川 攀枝花 617000；2汕頭大學醫學院生理教研室)

神經系統與內分泌系統之間存在緊密聯系，而下丘腦在整個神經內分泌系統中處于核心地位〔1〕。隨著年齡的增長，生物各部分功能出現衰退，下丘腦的神經內分泌功能發生紊亂，可誘發機體能量代謝失衡、肥胖、自主神經功能混亂、高血糖、高血壓、胰島素抵抗和性功能勃起障礙等多種代謝綜合征；同時糖尿病(高血糖)、高血壓和高脂血癥等常見的老年疾病所產生的炎癥因子又會反過來作用于下丘腦細胞，加重中樞神經內分泌系統功能的失調，推動衰老的不可逆發展〔2,3〕。利用大鼠、小鼠等下丘腦原代細胞作為的神經內分泌失調研究的細胞體外模型是目前研究熱點之一〔4〕。但由于原代細胞培養復雜、耗時且細胞均質性差。所以用恰當的細胞株系代替原代細胞作為神經元的研究模型是一個不錯的選擇〔5～8〕。NG108-15細胞是一個由小鼠神經母細胞瘤與大鼠神經膠質瘤細胞雜交后獲得細胞系。在其分化后，細胞可以形成類似于神經突觸的突起。因此，許多研究均采用NG108-15細胞系作為研究神經元功能的重要細胞模型〔9,10〕。然而由于其雜合性，因此很難確定其細胞的神經內分泌特性是偏向于小鼠還是大鼠，從而給相關的細胞分子生物學研究帶來困難。為了使細胞試驗與動物試驗結果吻合，提高研究結果的價值。本研究設計了兩組分別來自大鼠和小鼠神經內分泌基因的引物序列來分析基因表達的特性，以確定該細胞系的適合性。

1 材料與方法

1.1試驗試劑與材料 NG108-15細胞系(汕頭大學醫學院生理教研室)，新生大鼠(汕頭大學醫學院試驗動物中心，合格證號No.20170803)，新生小鼠(汕頭大學醫學院試驗動物中心，合格證號No.20170803)，DMEM培養基、胎牛血清、雙抗(青霉素+鏈霉素，Gibco)，雙丁酰環磷酸腺苷(dc-AMP，Sigma)，胰酶，神經元專用培養基(neurobasal medium)，B27，L-谷氨酸，阿糖胞苷(Sigma)，磷酸鹽緩沖液(PBS)緩沖液，RNA提取試劑盒(Takara)，RNA逆轉錄試劑盒(Takara)，SYBR熒光定量PCR試劑盒(Takara)，瓊脂糖，溴化乙錠。

1.2方法

1.2.1NG108-15細胞的分化培養 將NG108-15細胞按1×104個/ml密度接種到直徑為35 mm的細胞培養板上，加入1 ml DMEM培養基進行培養。培養2 d后，加入含1 mmol/L雙丁酰環磷酸腺苷的DMEM培養基進行分化培養。此后每隔3 d換液1次，7 d后待細胞完全分化出細胞突觸后，收集所培養細胞待用。

1.2.2原代細胞的培養 分別將剛出生的小鼠和大鼠帶回實驗室，用解剖工具在低溫無菌條件下快速取出下丘腦組織，并用胰酶在37℃下將下丘腦組織消化為單細胞懸液。將此細胞懸液按1×104個/ml密度接種到直徑為35 mm的細胞培養板上，加入1 ml含B27的neurobasal medium培養基進行培養，培養第2天加入含阿糖胞苷的培養基進行培養48 h后，換回含B27的neurobasal medium培養基繼續進行培養，此后每3天換液1次，直到第7天原代細胞培養成熟，收集所培養的原代細胞待用。

1.2.3逆轉錄PCR 將上述收集的各組細胞，先用PBS進行清洗，然后各加入0.5 ml RNA提取試劑進行總RNA的提取，并用50 μl雙蒸水溶解所提取RNA后，放于-70℃冰箱保存待用。每組取7 μl總RNA按照逆轉錄試劑盒的操作要求，將其逆轉錄為20 μl的cDNA，并放于20℃保存待用。每組取1 μl cDNA，按照SYBR熒光定量PCR試劑盒的操作要求，在ABI7500上進行PCR擴增和檢測分析。擴增產物，進一步通過瓊脂糖電泳進行成像分析。PCR反應引物系列見表1，其中β-actin為內參基因，其余的瘦素受體基因(lepr)、前阿黑皮素原基因(pomc)、神經肽Y基因(npy)和刺鼠相關蛋白基因(agrp)均與下丘腦的神經內分泌相關。

1.3統計學方法 應用SPSS22.0軟件行t檢驗、χ2檢驗。

表1 熒光定量PCR的引物序列

2 結 果

2.1細胞形態 NG108-15細胞，大鼠及小鼠的下丘腦原代培養細胞在按各自的培養條件培養7 d后的結果見圖1。從圖1可以看出三類細胞均有神經元的突觸分化，但NG108-15細胞體積較大，成分散生長。大鼠和小鼠的原代培養細胞，則體積較小，細胞成簇生長，細胞間有明顯的突觸聯系。

2.2兩組引物的PCR擴增結果 利用由大鼠基因設計的引物序列，檢測NG108-15細胞和大鼠原代細胞的基因擴增效率，結果見表2和圖2A。內參基因β-actin的擴增在兩組細胞內擴增正常且無差異，說明兩組細胞的起始模板量相等。但剩余的所有基因卻只能在大鼠原代細胞中正常擴增，而在NG108-15細胞卻擴增失敗。利用小鼠基因設計的引物序列，檢測NG108-15細胞和小鼠原代細胞的基因擴增效率，結果見表3和圖2B。所有基因能在NG108-15細胞和小鼠原代細胞中進行擴增，且擴增效率差異無統計學意義(P>0.05)。

利用小鼠和大鼠的兩組引物序列，同時檢測NG108-15細胞的基因擴增效率，結果見表4和圖3。所有來自小鼠的引物序列擴增正常，而來自大鼠的引物序列則除了內參基因β-actin 擴增正常外，其他均擴增失敗或擴增效率低下。

從以上結果可以看出，盡管NG108-15細胞是由大鼠膠質瘤細胞與小鼠神經母細胞通過細胞融合所得的雜交瘤細胞株系，但其有關神經內分泌有關的細胞分子生物學特性則更多的與小鼠原代細胞相近而與大鼠的差異較遠。

圖1 各組細胞的形態(×100)

表2 大鼠基因設計的PCR引物序列在NG108-15細胞與大鼠下丘腦原代細胞中的熒光定量PCR結果次，n=3)

UD*為無法檢測；表4同

表3 小鼠基因設計的PCR引物序列在NG108-15細胞與小鼠下丘腦原代細胞中的熒光定量PCR結果次，n=3)

A：由大鼠基因設計的PCR引物(β-actin，lepr，pomc，npy，agrp)在大鼠下丘腦原代細胞和NG108-15細胞中的PCR擴增結果，第1泳道為DNA分子標記，其余奇數泳道為大鼠下丘腦原代細胞，偶數泳道為NG108-15細胞；B：由小鼠基因設計的PCR引物(β-actin，lepr，pomc，npy，agrp)在小鼠下丘腦原代細胞和NG108-15細胞中的PCR擴增結果，第1泳道為DNA分子標記，其余奇數泳道為小鼠下丘腦原代細胞，偶數泳道為NG108-15細胞圖2 由大、小鼠基因設計的PCR引物

表4 由小鼠基因和大鼠設計兩組PCR引物在NG108-15細胞中的熒光定量PCR結果次，n=3)

第1泳道為DNA分子標記，其余奇數泳道為依據小鼠基因設計的引物序列，偶數泳道為依據大鼠基因設計的引物序圖3 大鼠與小鼠基因的引物序列

3 討 論

新分離的原代神經細胞是研究神經元生理及病理變化功能的最佳選擇。但存在的缺點主要是細胞分離培養復雜耗時，細胞死亡率較高，細胞存在異質性。細胞系則具有培養方法簡單高效，均質性好等優點。因此，細胞系是研究細胞功能的理想工具。NG108-15細胞系是一個重要的神經細胞模型〔11，12〕。NG108-15細胞系可用于研究神經細胞的離子通道、膜受體和神經遞質等生理生化特性。張柱霞等〔13〕研究了5-氮-2′脫氧胞苷對神經細胞系NG108-15細胞周期的作用及相關機制，發現5-aza-cdR可以抑制NG08-15細胞的增殖，其抑制作用可能是通過降低DNMT1表達實現的。

雙丁酰環磷酸腺苷可以刺激NG108-15細胞分化，比如細胞直徑和神經突起增長。許多研究均采用分化的NG108-15細胞作為研究神經元離子通道和膜受體的重要工具〔14，15〕。但是很少有人考慮該雜合細胞的生化特性是偏向于大鼠還是小鼠細胞特性。本研究結果發現，在多個與神經內分泌相關基因的表達研究方面，該細胞系更適合為小鼠的體外細胞研究模型。由此可以看出若要將NG108-15細胞系作為神經內分泌失調研究的體外模型，其研究結果更適合與小鼠動物試驗相結合。