循環miRNA監測肝細胞癌的研究

趙瑤瑤 高川 胡佳杰

摘要：肝癌是目前臨床上最常見的惡性腫瘤之一，其早期診斷的困難導致了后期治療的不理想化，因此肝癌的死亡率常年居高不下。現有的研究結果顯示，多種miRNA的表達在正常人群和肝癌患者群體的組織甚至體液中的表達量有很大的差異。miRNA可能在肝臟腫瘤的發生發展中起到了至關重要的作用。本文就肝臟的生理功能、肝細胞癌的發生發展、常規診斷、miRNA與肝癌的關系等方面的研究作一綜述。

關鍵詞：肝癌;miRNA;早期診斷

中圖分類號：R735.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.08.016

文章編號：1006-1959（2019）08-0048-05

Abstract：Liver cancer is one of the most common malignant tumors in the clinic. The difficulty in early diagnosis leads to the unsatisfactory treatment in the later stage. Therefore， the mortality of liver cancer is always high. The existing research results show that the expression levels of various miRNA are significantly different in the tissues and even body fluids of normal populations and liver cancer patient populations. miRNA may play a crucial role in the development of liver tumors. This article reviews the physiological functions of the liver， the development of hepatocellular carcinoma， routine diagnosis， and the relationship between miRNA and liver cancer.

Key words：Liver cancer;microRNA;Early diagnosis

肝臟疾病會影響人體的多種生理機能，其中最嚴重的肝臟疾病以肝細胞癌為代表。肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常見的惡性肉瘤，它是原發性肝細胞癌的最常見形式，也是癌癥相關死亡和發病的主要原因之一。大多數肝細胞癌病例與慢性肝硬一起發展。但是，慢性乙型肝炎和丙型肝炎患者甚至在不經過肝硬化階段的情況下發生HCC的風險也很高。由此看來，對風險人群的篩查和監測對于HCC管理至關重要。而且晚期HCC預后不良且有效治療的選擇方案很少。目前，只有甲胎蛋白（AFP）常規用作臨床實驗室中的循環HCC標志物，但是其靈敏度和特異性是十分有限的。因此，尋找可用于早期檢測HCC的新穎且可靠的生物標志物迫在眉睫。微小RNA（miRNA）是一類長度約22個核苷酸的單鏈非編碼細胞RNA。動物中的miRNA通常通過不完全堿基配對與靶基因的3'非編碼區（3'UTR）結合來調節靶基因的表達，從而誘導降解或翻譯抑制，實現在轉錄后水平調節靶基因的表達。miRNA已被證明與HCC的形成有關，這是支持其作為治療靶點或疾病生物標志物的潛力點。本文就肝臟的生理功能、肝細胞癌的發生發展、常規診斷、miRNA與肝癌的關系等方面的研究作一綜述。

1肝臟的生理功能

肝臟是人體內最大的器官，其重量約占體重的1/20。它具有多項重要的生理功能，比如內分泌和外分泌功能。肝臟的內分泌功能支持分泌多種激素，包括胰島素樣生長因子、血管緊張肽原、促血小板生成素。肝臟的外分泌功能主要指其分泌膽汁的能力。除此之外，肝臟的代謝功能同樣不容忽視，它不僅操控著糖酵解和尿素代謝，血液的解毒功能以及體內的膽固醇水平同樣受其調控，同時它還能夠支持造血系統和消化系統的運轉[1]。肝臟在糖原儲存、藥物解毒和多種血漿蛋白（包括白蛋白和載脂蛋白）的分泌等方面都起著至關重要的作用。

肝小葉是肝臟的功能性組織單位，它由多角形肝細胞索環繞中央靜脈（肝門靜脈的終末分支）排布而成。組成肝小葉的細胞類型有多種，其中包括肝細胞、膽管細胞、內皮細胞、星狀細胞和庫普弗細胞[1]。

肝細胞是肝臟的主要實質細胞，大約占肝臟總質量的80%。肝細胞為多面立方體形，可分泌血清白蛋白、膽汁以及一些重要的凝血因子。排列于膽管上的內皮細胞被稱為膽管細胞，此處主要指肝內膽管，但值得注意的是膽管細胞行使其功能時遍及整個膽道系統[1]。星狀細胞位于Disse腔中，構成了肝臟的主要間充質成分。在靜息狀態下，是維生素A的主要儲庫。當肝臟受損或感染時，星狀細胞被激活，并轉化為表達α平滑肌肌動蛋白的肌成纖維細胞樣細胞，這種細胞能夠沉積細胞外基質并指導暫時性的纖維化瘢痕形成。另外，星狀細胞還能調控肝臟的血管發育，能在靜息狀態下行使周細胞功能。庫普弗細胞（KCs）是存在于血竇內的肝巨噬細胞，占肝總細胞的15%。在肝臟再生功能中，KCs通過影響肝祖細胞的侵襲能力發揮重要作用。

總之，肝臟是人體正常生理過程中一個如此重要的調節器，故而肝臟疾病（如乙肝、肝纖維化、肝硬化和肝細胞癌）的發病率和死亡率都相當高。由此引發的沉重的經濟負擔和健康危機，促使人們在對控制肝細胞分化和功能等基本發育機制的理解方面有了更深的渴求。

2 HCC的發生發展

HCC是全球癌癥致死的第2大病因。自2010年起，美國的肝癌總患病率呈持續快速增長模式，目前雖然在HCC的診斷和治療方面的研究工作有了一定的進展，但是臨床上可以通過手術進行切除的腫瘤所占的比例仍然很低，且術后復發率高。在HCC的各種治療措施中，肝移植術通常能夠為患者帶來佳音。過去的30年中，肝移植術的進步促使被診斷為局部腫瘤的患者在肝癌的幸存者中占有絕對優勢[2]。然而，這對于那些被診斷出有轉移瘤塊的患者而言毫無意義[3]，并且其高昂的經濟代價注定了它僅能造福于少數患者。總的來說，各項不利因素最終導致肝癌患者的總生存率低至18%[2]。

HCC的發展受到包括遺傳和環境在內的多重因素的影響，因此，個體腫瘤往往表現出很大程度上的異質性。具體來說，HCC是在肝硬化的基礎上發展而來的。此外，乙型肝炎病毒（HBV）[4]、丙型肝炎病毒（HCV）[5]、接觸來自曲霉屬的黃曲霉毒素B1、酗酒以及非酒精性脂肪性肝炎[6]等因素都進一步促進了腫瘤的生成。就地域特征而言，HCC是一個世界范圍內的疾病，然而在東南亞和撒哈拉以南的非洲，由于HBV感染和接觸受污染谷物中的黃曲霉毒素B1等原因，其發病率尤其高。此外，由于慢性HCV感染，西方國家的HCC患病率也在逐年增長[7]。

一般來說，HCC的自然發展進程可分為分子階段、臨床前階段和臨床/癥狀階段。分子階段是腫瘤的生物發生過程，通常指的是以慢性肝炎和肝硬化為特征的腫瘤發生前階段，此階段實現了肝細胞、膽道上皮細胞或干細胞的轉化。肝細胞、膽道上皮細胞等分化細胞的遺傳學改變導致了高度增生型細胞的產生，這類細胞有抗凋亡的作用，而干細胞的遺傳學轉變則會引導細胞走向一條異常的分化之路。在臨床前階段，患者通常無癥狀，此時影像學檢查能否發現腫瘤并無定數。臨床階段則與癥狀息息相關，這一時期通常發生在腫瘤生長至4～8 cm時。

研究HCC個體的發生發展或可為其早期發展階段的治療干預提供洞見。為了進一步明確其發生發展狀況，目前該領域正在嘗試通過系統生物學方法，將癌癥基因組學、表觀遺傳學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學的高通量數據整合到計算框架中，從而構建出高分辨率的HCC發展圖譜[8]。

盡管目前對HCC分子多樣性的研究已經有相當大的進展，但不可否認的是這還只是個開始[9]。這類研究的進一步推進不僅是提高HCC的診斷和管理策略的保障，也是施行有效監測計劃的基礎。現有的研究顯示，癌變與異常的基因組和轉錄環境有關，其環境超出了蛋白質編碼基因的范疇，延伸到幾類結構和功能不同的非編碼RNA上[10]。轉錄中最初的表觀遺傳變化通常是由生長因子和促炎性細胞因子的增加引起的。此后，染色體重排導致的原癌基因擴增和抑癌基因缺失進一步引發癌變。若HBV整合到基因組中，或能通過插入突變的方式促進肝癌發生，且HBV和HCV都有直接調節宿主的信號通路促進肝細胞轉化的潛能。

3 HCC的常規診斷

目前HCC的常規檢測方法主要包括影像學檢查、組織活檢和血液學檢查，其中影像學檢查起鑒定性作用。但是影像學檢查存在許多無法忽視的弊端，例如：常規的超聲檢查其準確性和靈敏度非常有限。CT和MRI技術受其自身復雜性和高成本等因素的影響，在HCC的監測方面實用性都不高。而活檢無疑會給患者帶來不小的痛苦，且其檢出率會受到多重因素的干擾，同時還存在相當大的安全隱患。血液學檢查毫無疑問是最適合推廣的檢測方法，但是就目前來看，AFP和其他的一些血清生物標志物在HCC的診斷中只能起次要作用。由此可見，開發新的血清生物標志物用于HCC的診斷迫在眉睫。

4循環miRNA與肝癌的關系

4.1循環miRNA? 新型血清生物標志物的發現有望實現肝細胞癌的早期診斷及預后改善。目前大量學者通過研究發現了一種極具研究前景的新型分子生物標志物——miRNA。miRNA是短的（22nt）單鏈非編碼RNA，其以序列特異性方式結合信使RNA（mRNA）來調節基因表達。它在基本的生物過程（如分化，增殖，凋亡和維持機體內穩態）中發揮著重要作用。迄今為止，已經有超過500種miRNA在人類中完成了鑒定工作。研究發現，首先在細胞核中，在RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ的介導下轉錄miRNA相關基因到初級miRNA（pri-miRNA），此時的pri-miRNA長達幾千nt，隨后在微處理復合物Drosha-DGCR8的作用下，將轉錄得到的pri-miRNA切割成單個或多個前體miRNA（pre-miRNA），此時的pre-miRNA是一種發卡結構，到此時細胞核內進行的過程結束。接著在Exportin-5-Ran-GTP復合物的作用下將pre-miRNA從細胞核內轉運至細胞質中，被另一種RNaseⅢ內切核糖核酸酶Dicer進一步加工，將pre-miRNA剪切為成熟的長度，這時miRNA仍處于雙鏈狀態，緊接著雙鏈的miRNA被轉載進AGO2蛋白，形成RISC（RNA誘導沉默復合體），在RISC復合物中miRNA雙鏈中的一條鏈保存下來，稱之為“guide”鏈，另一條鏈“passenger”則排出復合物外并迅速降解，成熟的miRNA可介導下游靶標mRNA 的轉錄抑制以及脫腺苷化（圖1）。主要miRNA的交替加工本被稱為同分異構體，可以導致成熟的miRNA有別于其基因組序列。這種同分異構體是多次加工的產物，其中包括通過增添核苷酸（通常是腺嘌呤或尿嘧啶）修飾3'末端、核苷酸的內部編輯以及由Drosha和Dicer精確切割位點的變異性導致的5'末端缺失/添加。同分異構體在不同的發育過程和疾病狀態下相對分布有所改變。例如，在果蠅發育早期，miRNA的3'末端有豐富的非模板添加腺苷;某些異構體在良性胃組織中比較有優勢，而有些異構體則在胃腫瘤中更占優勢。經過一系列加工得到的成熟miRNA（包括組織特異性miRNA）進入血液循環后，可通過靈敏的RT-PCR擴增技術進行檢測（圖2）。

miRNA具有的組織特異性表達模式，增添了它作為候選生物標志物的獨特魅力。在傳染病領域，病毒特異性miRNA或某類微生物共有的miRNA可以在血液中進行檢測。在癌癥領域，miRNA表達出現失控，一些通常在胚胎期表達的miRNA被重新激活，與此同時那些具有腫瘤抑制活性的miRNA下調。由此可見，miRNA的表達可作為腫瘤來源的指紋圖譜和疾病侵襲性的標志。

4.2循環miRNA與HCC的聯系? miR-483-5p可能是與癌癥患者生存時間縮短相關的生物標志物[11]。其早期也被認為是HCC的血清標志物。胰島素樣生長因子2（IGF2）是肝細胞癌體內實驗模型的表達驅動因子。miR-483-5p是從IGF2位點表達的內含子miRNA，介導細胞核功能，主要靶向胎兒IGF2 P3轉錄本的5'-UTR，增加胎兒IGF2信使RNA水平。有研究發現，IGF2在肝細胞癌患者中顯著過表達[12]。具體來說，乙肝病毒X（HBx）蛋白低甲基化IGF2胎兒啟動子，使IGF2 P3 mRNA在HBV感染的肝細胞癌患者中表達[13]。miR-483-5p的表達并不僅僅依賴于IGF2，它與IGF2 P3 mRNA的5'-UTR結合，觸發IGF2的表達，形成正反饋回路[14]。且miR-483-5p在IGF2依賴性肉瘤細胞中的異位表達與體內腫瘤發生增加相關。就miR-483-5p的作用機制而言，它可以整合到線粒體分裂機制中，通過靶向FIS1影響線粒體凋亡通路[15]，或通過靶向RhoGDI1和ALCAM促進上皮間充質轉化，影響肺腺癌的侵襲轉移[16]。它也通過結合SRF（血清反應因子）的3'-UTR影響血管生成[17]。近年學術界在MiR-483-5p的作用機制研究方面成果頗豐。比如，miR-483-5p通過抑制多發性對稱性脂肪瘤中的RhoA/ROCK1/ERK1/2途徑促進脂肪形成[18];miR-483-5p通過靶向RBM5促進前列腺癌細胞增殖和侵襲[19];有報道稱，KLF4-miR-483-CTGF通路的測定和評價對于監測川崎病的發展和治療具有重要意義[20]。有學者通過血清miRNA篩選和功能研究發現，miR-483-5p是系統性硬化癥纖維化的潛在驅動因素[21]。除此之外，目前還有很多種miRNA被認為可以直接靶定其下游靶點或者間接通過被其上游調節器靶定，從而對肝細胞癌起到促進或者抑制的作用，見表1。

5總結

利用血清循環miRNA作為早期檢測肝細胞癌的新型生物標志物可以簡化臨床檢測手段，降低檢測風險（組織活檢時可能產生的癌細胞轉移），減輕患者的痛苦和抵觸情緒，真正做到全面篩查肝細胞癌的高危人群，提高檢測的準確性。

綜上所述，miRNA作為肝細胞癌的早期檢測標志物有著良好的應用前景。

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收稿日期：2019-3-9;修回日期：2019-3-19

編輯/楊倩

作者簡介：趙瑤瑤（1994.6-），女，湖北孝感人，碩士，主要研究領域為分子生物學

通訊作者：胡佳杰（1967.12-），男，湖北天門人，博士，副教授，研究方向為分子病毒學