多功能納米基因載體的制備與分析

劉詩音

摘要：本文通過反向微乳聚合等化學方法，成功制備出一種集磁性、熒光于一體的SiO2納米粒子，并以多聚賴氨酸（PLL）對其表面進行修飾，修飾后的納米粒子能夠有效地與DNA結合和分離，并保護DNA免受DNaseI的降解。該納米基因載體能夠介導外源DNA轉化至植物細胞當中，為納米基因載體在轉基因植物的研究中及應用打下了基礎。

關鍵詞：納米粒子;基因載體;轉基因植物

中圖分類號：R944.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：? A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2019.12.022

納米技術指制造出0.1～100nm量度的物質材料，直接操縱原子、分子、原子團或分子團，探究原子或分子的運動特性和規律[1-3]。生物納米技術是生物技術和納米技術的融合技術，是有關生命科學和納米技術的新方法、新技術[4-6]。納米技術在生物技術中的應用目前主要包括以下方面：基因載體[7-11];納米尺度上的單細胞活體實時檢測[12-17];藥物的靶向和定向釋放細胞[18-24]、DNA的分離等[25-27]。

本文擬構建一種新型的多功能納米基因載體，即集熒光、磁性于一體的二氧化硅納米基因載體。將熒光量子點和磁性納米微粒同時集成到尺寸可控的硅納米粒子中，并在納米粒子表面修飾多聚賴氨酸（Polylysine，PLL）。熒光量子點被包埋在納米載體內部，便于實時、穩定、高效檢測。引入磁性功能，可在外磁場的作用下，提高外源基因進入細胞的效率，這將為納米基因載體在植物轉基因中的研究與應用提供嶄新的途徑。

1 實驗方法

1.1熒光磁性SiO2納米粒子（Fluorescence-magnetismsilicananopaticles，FMSNPs）的制備

取100ml三口瓶，加入25ml環己烷，4ml正己醇，5ml TritonX-100，0.25ml正硅酸乙酯，0.25ml Fe3O4，劇烈攪拌30min后形成反膠束。水浴加熱25℃，機械攪拌，加入CdTe溶液0.25ml，氨水0.075ml，避光反應24h。反應結束后，取反應液體滴加丙酮破乳，靜止沉淀，有乳白色微粒生成。8000rpm，10min，棄上清，收集沉淀。沉淀用乙醇洗滌3次，100℃真空干燥，室溫貯存備用。通過掃描電鏡檢測熒光磁性SiO2納米粒子的尺寸分布。

1.2 熒光磁性SiO2納米粒子的表面修飾

PBS磷酸緩沖液的配制，按比例稱取磷酸氫二鈉與磷酸二氫鈉，配制成pH=7.4的0.2mol/ml溶液，取2.5ml，稀釋20倍至50ml。

取1mg熒光磁性SiO2粒子（FMSNPs）溶于1ml PBS，再加入0.05ml（1mg/ml）多聚賴氨酸（PLL），室溫震蕩1h，用Zata電位儀檢測納米粒子是否成功被PLL修飾。

1.3修飾PLL的熒光磁性SiO2納米粒子與DNA的結合

納米粒子與質粒DNA按照50∶1，30∶1，10∶1，5∶1，

2∶1，1∶1的比例將PLL-NPS與質粒DNA混合，同樣將無納米粒子的PBS與DNA按照上述比例充分混合均勻，室溫放置0.5h，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 PLL修飾的熒光磁性SiO2納米粒子與DNA的分離

配制0.9%NaCl pH值為7.4 PBS溶液，按1∶1的比例（各5ul）與NPS-PLL-DNA結合物混合，37℃放置2h。

1.5 熒光磁性SiO2納米粒子對DNA的保護作用

將DNAaseI按1U∶10ul的比例加入NPS-PLL-DNA結合物溶液中，37℃放置2h。

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PLL修飾的熒光磁性SiO2納米粒子與DNA的結合和分離。

2 結果與分析

2.1熒光磁性SiO2粒子的尺寸

電鏡分析：熒光磁性SiO2的粒子電鏡圖見圖1，尺寸：50～80nm。

性狀：白色粉末，溶液成乳白色，340nm紫外燈照射下成粉紅色。

2.2 熒光磁性SiO2納米粒子的表面修飾的結果與分析

zeta電位儀檢測，未經修飾的熒光磁性SiO2納米粒子的電位值-3.6mV，經PLL修飾后的熒光磁性SiO2納米粒子的電位值為12.4mV，說明PLL已經成功地修飾到熒光磁性SiO2納米粒子表面上，并具有較強的正電性。

2.3修飾PLL的熒光磁性SiO2納米粒子與DNA結合分析

FMSNPs與質粒DNA按50∶1，30∶1，10∶1，5∶1，2∶1，1∶1的比例進行混合，FMSNPs與質粒DNA結合狀況見圖2，1～4號孔道代表空白對照，即不含FMSNPs，5～8號FMSNPs與質粒DNA混合的樣本。從電泳圖上可以清晰地看到FMSNPs與質粒DNA混合的樣本均沒有DNA條帶。當質粒DNA結合到NPS-PLL上時，在電泳過程中，因為NPS-PLL粒徑很大，無法在膠板上移動，被滯留在膠空內，說明質粒DNA已經結合到NPS-PLL上。

2.4 修飾PLL的熒光磁性SiO2納米粒子與DNA的分離分析

PLL修飾的熒光磁性SiO2納米粒子與DNA的分離：0.9%NaCl pH=7.4? PBS溶液可將NPS-PLL-DNA結合物上的質粒DNA洗脫下來，從照片可以看出，第7～11的試樣在260nm紫外光出現DNA條帶，說明質粒DNA已經從NPS-PLL-DNA結合物上洗脫下來，如圖3。

2.5修飾PLL的熒光磁性SiO2納米粒子對DNA的保護實驗的結果與分析

修飾PLL的熒光磁性SiO2納米粒子對DNA的保護：DNaseI可將質粒DNA酶切，切除下來的DNA可在膠板上泳動并在260nm紫外光出現DNA條帶。從照片上可以看到2～6孔的試樣并沒有出現DNA條帶，說明質粒DNA沒有被DNAaseI酶切，所以說NPS-PLL對DNA有保護作用。

3 結語

本文通過微乳聚合等化學方法成功制備了一種集熒光、磁性于一體的PLL SiO2納米粒子，并以PLL對其進行表面修飾，修飾后的納米粒子能夠成功地與DNA結合和分離，并保護DNA免受DNaseI的降解作用，同時，該納米基因載體能夠介導外源DNA轉化植物細胞中，這為納米基因載體在植物轉基因中的進一步應用打下了基礎。

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