不同菌種菊苣根發酵提取物的揮發性成分分析及應用

常 健，徐世濤，黃 靜，劉勁云，王夸平，徐重軍，陳 媛，王乃定，段焰青，李源棟，楊培香*

（1.云南中煙新材料科技有限公司，云南 昆明 650106；2.云南中煙工業有限責任公司技術中心，云南 昆明 650202）

菊苣（Cichorium intybus L.）是一種灌木叢生的多年生草本植物，根肉質、短粗[1]，產于東北、西北、華北、山東、山西等地[2]。菊苣為藥食兩用植物，菊苣葉可調制生菜，根含菊糖及芳香族物質，具有清熱解毒、降壓利尿[3]、健胃[4]、保肝作用[5]，同時還具有增強免疫能力、抗炎、降低膽固醇和血糖等功效[6-7]，目前被廣泛用于咖啡、飲料、茶、保健品、食品、中藥中。烘烤后的菊苣提取物具有類似可可或咖啡的焦香味，主要來源于菊苣干片經焙炒后發生美拉德反應產生的香味物質[8]，用于煙草加香中可改善刺激，增強勁頭。菊苣提取物已成為煙草工業的重要香料之一，其主要含有三萜、倍半萜、有機酸等成分[9]，何軼等[10]對菊苣根的非揮發性成分進行了分析，鑒定出乙酸降香萜烯醇酯、蒲公英萜酮等12種化學成分。但對菊苣浸膏揮發性成分方面的研究報道相對較少；梁宇等[11]采用固相微萃取/氣相色譜-質譜（solid-phase microextraction/gas chromatograph-mass spectrometer，SPME/GC-MS）聯用技術對菊苣浸膏揮發性成分進行鑒定，共鑒定出38種化學成分；周靜媛等[12]對云南祿勸、石林以及青海西寧三個不同產地栽培的菊苣進行揮發性成分分析對比，分別鑒定出29種、35種、26種化學成分。利用不同的菌種對菊苣根進行發酵，并對其發酵提取物揮發性成分進行分析和對比評吸，國內還未見報道。

由于所提及的菊苣根發酵提取物主要應用于卷煙加香，菌株的選擇無先例可參考，擬選取在煙葉發酵過程中，能夠使煙葉的青雜氣、刺激性、香氣質量等得到顯著改善的菌株來對菊苣根進行發酵，段焰青等[13]從煙葉中分離出長孢諾德酵母菌（Lodderomyceselongisporus）并制成菌劑，噴灑于煙絲上進行發酵，有效的提高烤煙品質和增加煙葉香氣，煙葉評吸品質得到明顯提升；黃靜文等[14]從煙葉表面分離出短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）制得菌劑，噴灑于煙絲上進行發酵，煙葉的化學成分及比值更加協調，煙葉香氣質改善，香氣量增加，煙葉內固有的雜氣和刺激性減輕。因此，分別利用短小芽孢桿菌和酵母菌發酵微波預處理后的菊苣根提取物進行揮發性成分分析對比，并通過卷煙加香實驗評價，探索不同菌種發酵菊苣提取物揮發性成分差異及對提高卷煙吸食品質的作用，為進一步開發菊苣根的香料價值提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菊苣根：云南石林基地；短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、長孢洛德酵母（Lodderomyces elongisporus）：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（保藏號分別為CGMCCNO.3411、CGMCCNO.6645）；二氯甲烷、甲醇、正己烷（均為優級純）、無水硫酸鈉（分析純）：百靈威科技有限公司提供；正構烷烴C7-C30：美國Sigma-Aidrich公司。

1.2 儀器與設備

Agilent7890A/5975C氣相色譜-質譜聯用儀：美國安捷倫科技有限公司；BUCHIR-215型旋轉蒸發儀：瑞士BUCHI公司；WF20B型粉碎機：上海比朗制造有限公司；1 000 mL同時蒸餾萃取裝置：上海銀澤儀器設備有限公司；Milli-Q型超純水機：美國Millipore公司；MS204S萬分之一電子天平：瑞士Mettler Tloede公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理方法

（1）菊苣根微波預處理

稱取一定量的菊苣根，利用微波烘烤技術進行微波烘烤，微波功率45 kW，磁控管40根，出口溫度控制在110～120℃之間，烘烤時間6 min。

（2）長孢諾德酵母菌發酵菊苣根提取物的制備

取長孢諾德酵母菌CGMCCNO.6645活化培養，得到酵母菌活化菌液；菌種活化培養條件為28℃、160r/min振蕩培養，培養時間為28 h；將菊苣根粉碎后，添加15倍的水，滅菌制成待發酵樣品；將上述活化好的菌液接種于待發酵樣品中，菌株接種量為2%，發酵條件為轉速160 r/min，發酵溫度28℃，發酵時間36 h；發酵液經過濾、6 000 r/min離心后，取上清液。

（3）短小芽孢桿菌發酵菊苣根提取物的制備

取短小芽胞桿菌CGMCCNO.3411活化培養，得到短小芽孢桿菌活化菌液；菌種活化培養條件為37℃、150 r/min振蕩培養，培養時間為16 h；將菊苣根粉碎后，添加15倍的水，滅菌制成待發酵樣品；將活化好的菌液接種于待發酵樣品中，菌株接種量為2.0%，發酵條件為轉速150 r/min，發酵溫度37℃，發酵時間16 h；發酵液經過濾、6 000 r/min離心后，取上清液。

（4）揮發性香味成分的提取

稱取500 mL發酵上清液，倒入同時蒸餾萃取裝置（simultaneous distillation extraction，SDE）左側圓底燒瓶中，右側燒瓶中加入100 mL二氯甲烷，向兩個燒瓶中加入少許沸石，左側燒瓶用電熱套加熱，右側燒瓶60℃水浴加熱，同時蒸餾萃取3 h。收集二氯甲烷溶液，加入15 g無水硫酸鈉干燥12 h，除去水分，過濾，濾液減壓濃縮至1 mL。

1.3.2 氣相色譜-質譜檢測部分

（1）色譜條件

RXi-5sil MS石英毛細管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣（純度為99.999%），流速：1.0mL/min。升溫程序：初始溫度60℃，保持6 min；以3℃/min的速率升溫至180℃；再以10℃/min的速率升溫至230℃，保持10 min。進樣口溫度：250 ℃，進樣量：1.0 μL，分流比：10∶1，溶劑延遲6 min。

（2）質譜條件

離子源：電子電離（electron ionization，EI）源；離子源溫度：230℃；四極桿溫度：150℃；電離能量：70 eV；傳輸線溫度：280℃；掃描范圍（m/z）：40～450，質譜檢索圖庫：Nist11譜庫。

（3）定性方法

采用GC-MS測定酵母菌發酵菊苣根后提取物和短小芽孢桿菌發酵后提取物的揮發性化學成分，通過Nist11圖庫進行檢索確定其組分。

（4）感官評價

兩種菌種菊苣根發酵提取物添加到卷煙中后的感官評價及定性按照GB 5606.4—2005《卷煙第4部分：感官技術要求》規定的方法進行。

2 結果與分析

2.1 成分分析與鑒定

通過氣相色譜-質譜聯用儀測定兩種發酵菊苣根提取物的揮發性成分，長孢諾德酵母菌發酵菊苣根提取物的揮發性成分質譜見圖1，短小芽孢桿菌發酵菊苣根提取物的揮發性成分質譜見圖2，通過譜庫檢索并結合標準質譜圖和有關文獻確定各組分，結合色譜峰面積歸一化法定量計算各組分的相對百分含量，并對各成分氣味特征進行描述[15，18]，具體結果見表1。

由表1可知，A提取物的揮發性成分主要包括有機酸類10種、醛類9種、酯類4種、醇類4種、吡啶類3種、酚類3種、吡嗪2種、酮類2種、烯烴類2種、吡咯類1種；B提取物的揮發性成分包括有機酸類7種、醛類7種、醇類3種、吡嗪類3種、酚類3種、酮類3種、酯類2種、吲哚1種、吡咯1種、吡啶1種。

圖1 長孢諾德酵母菌發酵菊苣根揮發性成分總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components of chicory roots fermented by Lodderomyces elongisporus

圖2 短小芽孢桿菌發酵菊苣根揮發性成分的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of volatile components of chicory roots fermented by Bacillus pumilus

表1 不同菌種發酵菊苣根的揮發性成分及相對含量Table 1 Volatile flavor components and relative contents of chicory roots fermented by different strains

續表

兩種菌種發酵菊苣根中共分析鑒定出44種揮發性成分，其中A提取物的揮發性成分40種，B提取物的揮發性成分31種，二者相同成分27種。A和B中相同的化學成分有糠醛、糠醇、2-乙酰基呋喃、5-甲基糠醛、γ-壬內酯、2-乙酰基吡咯、4-乙烯基愈創木酚、丁香酚、香蘭素等。只存在于A中的揮發性成分有13種，分別是吡嗪、苯乙烯、2-乙酰基吡啶、壬醛、庚酸、異戊稀酸乙酯、喹啉、γ-壬內酯、（Z）-β-檀香醇、石竹烯氧化物、十五酸、亞油酸甲酯、油酸。B中獨有的成分4種，分別是2,6-二甲基吡嗪、γ-己內酯、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、吲哚。兩種發酵液中主要成分及含量比較見圖3。

由圖3可知，A中相對含量較高的成分依次為棕櫚酸（21.65%）、糠醛（18.05%）、亞油酸（6.27%）、3-甲基戊酸（4.96%）、2-乙酰基呋喃（4.62%）、己酸（4.44%）、2-乙酰基吡咯（3.38%）；B中相對含量較高的成分依次為糠醛（20.36%）、棕櫚酸（16.26%）、3-甲基戊酸（5.25%）、2-乙酰基呋喃（5.18%）、2-乙酰基吡咯（4.96%）、己酸（4.86%）、亞油酸（3.44%）。

圖3 長孢諾德酵母（A）和短小芽孢桿菌（B）發酵菊苣根主要揮發性成分的比較Fig.3 Comparison of main volatile compositions in chicory roots fermented Lodderomyces elongisporus(A)and Bacillus pumilus(A)

棕櫚酸具有調節煙草酸堿度，增加煙氣濃度、甜味、蠟味和豐滿度的功效，并間接影響煙草香氣，在煙氣中起到平衡作用[15]，但如果含量過高，會帶來粗糙感和刺激性[16]；亞油酸會增加煙氣的刺激性、粗糙感和蠟質感，對煙質不利[15]；棕櫚酸和亞油酸在A和B中的相對總含量為27.92%和19.70%，二者含量越高，煙氣的粗糙感和刺激性也越大[11]。

糠醛具有似面包、焦糖、谷物烘烤氣息、果香，可賦予卷煙烘烤香、果香、甜香[15]，可使卷煙香氣質細膩飄逸、煙氣透發性好、煙氣較飽滿，以及帶來一定的焦甜香和厚實留長感[17]；3-甲基戊酸是東方型卷煙中獨有成分，可賦予卷煙甜感、乳酪、水果香氣[18]；2-乙酰基呋喃具有草本的辛香[19]，應用于卷煙中，可增加焙烤香風味，改善煙氣細味[18]；己酸可增加卷煙的甜味、蠟味，使煙氣豐滿醇和[15]；2-乙酰基吡咯具有增加煙氣濃度，賦予煙草甜感，使煙草平和的作用[18]，是對卷煙香氣有重要作用的吡咯類成分之一。以上幾種成分的含量皆是B＞A，由圖可知，7種主要揮發性成分分別占總量的63.37%、60.31%。這7種成分是構成發酵菊苣根香氣的基礎成分。此外，存在于A和B中的一些化學成分，雖然含量不高，但對卷煙煙氣和吃味有重要作用，其中，有14種成分在A、B中含量無明顯變化，分別是2-甲基四氫呋喃-3-酮、糠醇、2-環戊烯-1，4-二酮、5-甲基糠醛、三甲基吡嗪、2-吡咯甲醛、苯甲醇、苯乙醛、鄰甲氧基苯酚、4-乙烯基愈創木酚、丁香酚、十五酸、硬脂酸、棕櫚酸甲酯。有3種成分在B中明顯大于A，分別是二甲基丁酸（0.62%）、苯乙醇（0.46%）、香蘭素（0.24%）。2-甲基丁酸可以增進水果、酒香和乳脂香味，使煙氣柔和滋潤，改善辛辣刺激；苯乙醇通常用于增加卷煙香味的圓潤和醇吸味[18]；香蘭素則是一種與煙香味非常協調，賦予煙氣豐滿柔和的煙香風味，也可以用來修飾可可、堅果、脂香等香韻[15]。同時僅存在于B中的4種成分也是重要的致香物質：2,6-二甲基吡嗪具有明顯的焦香或烤堅果香味，風味閾值極低[20]，可賦予煙草濃郁的烤香，對增強和改進煙草香味有明顯作用[15]；γ-己內酯賦予煙草果香、豆香、奶香和糖蜜香，與煙香協調；2-乙基-3,5-二甲基吡嗪有濃郁的可可香味，可賦予煙草烤香，豐富煙草香氣；吲哚微量時有茉莉香，持久，用于煙用香精中，與煙香協調[18]。

綜上，B中的揮發性成分雖然種類較少，但是構成發酵菊苣根中的基礎性成分中主要致香成分含量較高，且對煙草吸味呈副作用的成分含量較少。

2.2 卷煙加香實驗結果分析

不同添加量的兩種菌種菊苣根發酵提取物添加到卷煙中后的感官評價及定性描述[21]，結果見表2和表3。

表2 卷煙感官質量評吸結果Table 2 Results of smoking sensory quality of cigarette

表3 卷煙感官評吸結果描述Table 3 Description of smoking sensory quality of cigarette

感官評吸結果表明，兩種菌種發酵菊苣根提取物添加到卷煙中后抽吸品質均有所改善，具有掩蓋雜氣，純凈余味的作用，并使香氣豐富飽滿，烤甜香明顯，煙氣柔和透發，總體表現B＞A，添加比例以0.05%最佳。

3 結論

采用SDE/GC-MS法對菊苣根長孢諾德酵母菌發酵提取物（A）和菊苣根短小芽孢桿菌發酵提取物（B）的揮發性成分進行分析，并使用峰面積歸一化法計算各成分相對百分含量，結果表明，兩種菌種發酵菊苣根中共分析鑒定出41種揮發性成分，其中A提取物的揮發性成分40種，B提取物的揮發性成分31種，二者相同成分27種，分別是糠醛、糠醇、2-乙酰基呋喃、5-甲基糠醛、γ-壬內酯等。A中獨有的成分為13種，B中獨有的成分為4種。

研究結果表明，兩種菌種發酵菊苣根提取物中均含有大量的棕櫚酸、糠醛、亞油酸、3-甲基戊酸、2-乙酰基呋喃、己酸、2-乙酰基吡咯等揮發性成分，這7種成分既是構成發酵菊苣根香氣的基礎成分，也是卷煙中重要的香氣成分，其有機結合形成了發酵菊苣根的特征烤香、焦甜香味。卷煙加香試驗結果表明，菊苣根發酵提取物添加到卷煙中，具有掩蓋雜氣，純凈余味的作用，并使卷煙香氣豐富飽滿，烤甜香明顯，煙氣柔和，總體表現B優于A，添加比例以0.05%最佳。