延長(zhǎng)黃原膠緩釋期的技術(shù)研究

左文怡，朱 莉，楊澤林，詹曉北*

（1 江南大學(xué)生物工程學(xué)院/糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214122；2 無(wú)錫格萊克斯生物科技有限公司，江蘇無(wú)錫 214125）

黃原膠(XG)是一種微生物大規(guī)模發(fā)酵產(chǎn)生的較廉價(jià)的多糖材料，其作為醫(yī)藥緩釋基質(zhì)的作用已經(jīng)有了不少研究報(bào)道。Andreopoulos等[1]研究了醫(yī)用水楊酸在單純黃原膠基質(zhì)中的緩釋機(jī)制，發(fā)現(xiàn)藥物遞送過(guò)程在浸漬后的前10小時(shí)內(nèi)完成，并且水楊酸通過(guò)非Fickian運(yùn)輸釋放。Deb等[2]對(duì)黃原膠和Eudragit E100(一種丙烯酸樹(shù)脂)的聚電解質(zhì)復(fù)合物基緩釋片進(jìn)行了體內(nèi)外評(píng)估，確定了片劑呈持續(xù)釋放狀態(tài)。Rutz等[3]使用復(fù)合凝聚法將殼聚糖/黃原膠微膠囊化然后進(jìn)行霧化和凍干，得到了效果很好的類胡蘿卜素釋放載體。Shalviri等[4]用不同量的黃原膠和三偏磷酸鈉(STMP)合成淀粉交聯(lián)黃原膠聚合物，確定了這種淀粉交聯(lián)黃原膠水凝膠可以用作控釋制劑中的成膜材料。黃原膠在藥物釋放上的廣泛應(yīng)用證明了它用作包埋劑有緩釋的效果，但其親水性使緩釋效果不能長(zhǎng)久，因此在農(nóng)用緩釋系統(tǒng)方面應(yīng)用的相關(guān)研究較少，對(duì)黃原膠進(jìn)行改性或接枝共聚后得到新型的水凝膠再對(duì)其緩釋等性能進(jìn)行檢驗(yàn)的研究則有不少。如Sukriti等[5]制備了基于黃原膠與聚丙烯酸接枝共聚物的生物降解水凝膠，并證明了這種水凝膠具有殺菌和控制農(nóng)藥釋放的作用。魏釗華[6]研究了黃原膠與葡甘聚糖的復(fù)配體系，優(yōu)化后的復(fù)配體系可以用于緩釋部分藥物以及尿素等物質(zhì)。Bueno等[7]將黃原膠與檸檬酸酯化交聯(lián)，獲得的凝膠可以用于開(kāi)發(fā)pH控制的藥物傳遞系統(tǒng)。

還有一些對(duì)其他多糖進(jìn)行改性，并研究了改性產(chǎn)物的溶脹與釋放行為。Bajpai等[8]以N, N-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑將羧甲基纖維素和聚丙烯酰胺接枝得到了一種水凝膠，研究了交聯(lián)劑用量、引發(fā)劑用量、pH值等條件對(duì)凝膠溶脹的影響。Jamnongkan等[9]以戊二醛為交聯(lián)劑制作了聚乙烯醇(PVA)/殼聚糖(CS)水凝膠，研究了PVA/CS水凝膠的溶脹性、保水性及其對(duì)復(fù)合無(wú)機(jī)肥的釋放行為的影響。Li等[10]以PVA水溶液為粘合劑制作了小麥纖維素接枝聚丙烯酸水凝膠，研究了粒徑、pH、鹽離子對(duì)凝膠的溶脹和肥料釋放能力的影響。另有一些學(xué)者的研究也表明，PVA水溶液是一種很好的粘合劑[11-12]，并且在自然環(huán)境中可以生物降解[13]，對(duì)環(huán)境友好。

本研究以未改性的黃原膠作為主要基質(zhì)，以植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑水楊酸(SA)為釋放的模式物質(zhì)，選用PVA溶液為粘合劑，將粉末狀的黃原膠與水楊酸粘合造粒，通過(guò)混合少量其他物質(zhì)以期獲得更長(zhǎng)的釋放持續(xù)時(shí)間，開(kāi)發(fā)其應(yīng)用于農(nóng)用緩釋系統(tǒng)的可能性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

試驗(yàn)材料孔徑為29.96 μm的食品級(jí)尼龍網(wǎng)布制成的束口尼龍袋(誠(chéng)譽(yù)網(wǎng)業(yè))。試劑包括：黃原膠粉末(純度86.76%、水分9.23%、重均分子量2 × 107，由本試驗(yàn)室提供)；醋酸酯淀粉(食品級(jí)，天和生物科技有限公司)；硬脂酸(AR級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)，研磨成粉)；殼聚糖(BR級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)，脫乙酰度80%～95%，粘度50～800 mPa·s)；水楊酸(AR級(jí)，國(guó)藥集團(tuán))；聚乙烯醇 (沃凱 AH-26，粘度 58.0～66.0 mPa·s，醇解度97.0～98.0 mole%，國(guó)藥集團(tuán))；無(wú)水乙醇(AR級(jí)，國(guó)藥集團(tuán))；去離子水。

1.2 試驗(yàn)儀器

紫外分光光度計(jì)日立U-3900(日本日立株式會(huì)社)；電子分析天平TP-A300(福州華志科學(xué)儀器有限公司)；漩渦振蕩器QL-861(海門其林貝爾儀器制造有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱GZX-9070MBE(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；具塞玻璃層析柱(直徑 40 mm × 高 300 mm)；手動(dòng)制丸板 (網(wǎng)銷渠道)，燒杯等實(shí)驗(yàn)室常用器具。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 緩釋系統(tǒng)制作與試驗(yàn)條件 配制4%、5%、6%(w/v)三種濃度的PVA水溶液：各稱取4、5、6 g的PVA固體，分別加入100 mL去離子水中，在沸水浴下攪拌至溶解為澄清粘稠液體。

將各材料按設(shè)計(jì)的比例研磨混勻后，以PVA溶液為粘合劑將其粘合造粒，顆粒直徑6～10 mm，稱量未烘干前總重量(W0)后將顆粒在60℃下烘干24 h后再稱量烘干后總重量(W1)，裝入密封袋備用。

試驗(yàn)在室溫10～15℃條件下進(jìn)行。

1.3.2 緩釋顆粒中水楊酸含量理論值的計(jì)算公式

1)緩釋顆粒的烘干失水率(WL)：

式中：W1代表烘干后顆粒總重；W0代表烘干前顆粒總重。根據(jù)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)、計(jì)算，所有配方制成的緩釋顆粒烘干后的失水率均在40%～50%之間，為方便算出每個(gè)緩釋顆粒中水楊酸含量的理論值，統(tǒng)一將失水率定為45%。

2)單個(gè)緩釋顆粒中水楊酸含量的理論值(S)：

式中：W代表單個(gè)緩釋顆粒實(shí)際稱重重量；WL為緩釋顆粒烘干失水率；P代表根據(jù)設(shè)計(jì)的配方計(jì)算得來(lái)的水楊酸占比。

1.3.3 水楊酸含量的測(cè)定 采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)量溶液中水楊酸含量，參考鄧冬莉等[14]的方法，并進(jìn)行改進(jìn)。

1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：精密稱取水楊酸對(duì)照品0.1 g，置100 mL容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，得1 mg/mL水楊酸儲(chǔ)備液。

2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密吸取水楊酸儲(chǔ)備液0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2 mL 分別置50 mL容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，以60%乙醇為參比在300 nm處測(cè)其吸光度，以水楊酸含量為橫坐標(biāo)、吸光度OD300為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并擬合得到回歸方程。

水楊酸含量在5～40 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

3)回收率試驗(yàn)：精密吸取水楊酸儲(chǔ)備液0.6、1.2、1.8 mL，置于50 mL容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，在300 nm處測(cè)其吸光度；再將稀釋后的理論濃度代入 (2) 式回歸方程中計(jì)算出理論OD300值。實(shí)測(cè)OD300值與理論OD300值的比值為水楊酸的回收率。

經(jīng)過(guò)測(cè)量、計(jì)算，三個(gè)樣品的回收率分別為100.67%、102.98%、99.83%，在誤差接受范圍內(nèi)。

4)樣品測(cè)定：取1 mL待測(cè)樣品溶液，加入1.5 mL無(wú)水乙醇使其乙醇濃度為60%，在300 nm處測(cè)其吸光度，代入回歸方程得濃度后乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

1.3.4 水中溶出率法釋放曲線的測(cè)定[12]緩釋顆粒稱重后，根據(jù)公式計(jì)算其所含水楊酸量的理論值(S)，放入束口尼龍袋并放入500 mL燒杯中。在500 mL燒杯中加入200 mL水浸沒(méi)尼龍袋，每隔6小時(shí)將尼龍袋取出，收集濾液，測(cè)量體積及水楊酸含量后倒掉 ，加入新的200 mL水繼續(xù)浸泡，水楊酸累積釋放量增長(zhǎng)變緩時(shí)延長(zhǎng)測(cè)量間隔，重復(fù)浸泡至釋放量增長(zhǎng)無(wú)法檢出。以浸泡時(shí)間為橫坐標(biāo)，以累積的水楊酸釋放量占理論值的百分比(以下簡(jiǎn)稱水楊酸釋放率)為縱坐標(biāo)，繪制水楊酸釋放率隨浸泡時(shí)間變化曲線。

1.3.5 土柱淋溶法釋放曲線的測(cè)定[11-12]淋溶裝置如圖1所示。在具有活塞的玻璃層析柱內(nèi)先放一團(tuán)脫脂棉花，加入200 g河砂，以100 mL左右水使土柱完全潤(rùn)濕(打開(kāi)活塞至底端不再滴水)，然后在上面放置2顆緩釋顆粒與20 g河砂的混合物，隨即再于混合物上覆蓋100 g河砂，輕晃砂柱使砂面平整，在最上層覆蓋一層與底面相同的脫脂棉花，再以20 mL左右的水使上層土柱潤(rùn)濕。每隔1天用50 mL水潤(rùn)洗，收集濾液，測(cè)量濾液體積并取1 mL樣測(cè)水楊酸含量。以浸泡時(shí)間為橫坐標(biāo)，水楊酸累積釋放量為縱坐標(biāo)，繪制水楊酸累積釋放總量隨浸泡時(shí)間變化曲線。

圖 1 土柱淋溶裝置圖Fig. 1 Device diagram of soil column leaching

2 結(jié)果與分析

2.1 靜水浸出試驗(yàn)下的條件優(yōu)化

2.1.1 黃原膠粒徑的選擇 選擇0.178 mm、0.074 mm兩種不同粒徑的黃原膠粉末，控制其余變量一致，XG∶SA(w/w) = 2∶1，造粒直徑D = 7 mm，使用5% PVA溶液進(jìn)行造粒，(XG+SA) ∶5% PVA(w/w) = 1∶1。圖2表明，0.178 mm粒徑的黃原膠所制成的緩釋顆粒2天左右水楊酸釋放率大于80%，在2 天后基本不再上升；而0.074 mm粒徑的黃原膠制成的緩釋顆粒在1 天左右水楊酸釋放率就超過(guò)80%且?guī)缀醪辉偕仙Ｓ纱苏f(shuō)明，0.178 mm粒徑的黃原膠制備的顆粒緩釋效果優(yōu)于0.074 mm粒徑的黃原膠，因此，選定0.178 mm粒徑的黃原膠繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)。

圖 2 不同粒徑黃原膠制備的緩釋顆粒中水楊酸隨浸泡時(shí)間的釋放率Fig. 2 Release percentage of SA in slow-release granules prepared from different sizes of xanthan gum with soaking time

2.1.2 造粒條件的確定

2.1.2.1 造粒直徑的優(yōu)化 圖3a表明，不同造粒直徑的條件下，水楊酸釋放率在0～36 h上升都很快，36 h之后則有不同程度的減緩。在XG∶SA =8∶1，使用5% PVA溶液粘合造粒時(shí)，隨著造粒直徑的增大，所制得的緩釋顆粒對(duì)SA的釋放持續(xù)時(shí)間呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后減少的規(guī)律，8 mm直徑時(shí)的釋放持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)，在2 天左右。

圖 3 不同造粒直徑和粘合劑濃度下緩釋顆粒中水楊酸隨浸泡時(shí)間的釋放率Fig. 3 Release percentage of SA in prepared slow-release granules under different granule sizes and adhesive concentrations with soaking time

2.1.2.2 粘合劑濃度的優(yōu)化 如圖3b所示，確定造粒直徑為8 mm后，在XG∶SA = 2∶1的條件下比較了不同濃度的PVA溶液對(duì)SA釋放的影響。其中以4% PVA溶液造粒(混合粉末與4% PVA溶液重量比為1.1∶1)所得的顆粒釋放持續(xù)最長(zhǎng)，在2.5 天左右，高峰在前1.5 天。

因此，最終確定的造粒條件為：造粒直徑8 mm，以4% PVA溶液為粘合劑進(jìn)行造粒。

2.1.3 配方優(yōu)化

2.1.3.1 黃原膠 + 聚乙烯醇 + 水楊酸配方 用7種XG∶SA比例制成的緩釋顆粒(造粒直徑D = 8 mm，粘合劑4% PVA溶液)中，水楊酸隨浸泡時(shí)間的釋放率變化曲線如圖4所示。隨著黃原膠XG比例的加大，水楊酸隨浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)釋放率在下降；釋放持續(xù)時(shí)間在3∶1之后則是隨黃原膠比例增大而減少縮短。表現(xiàn)最佳的比例是3∶1，前1.5 天是釋放高峰期，2.5 天左右后釋放量基本不再增長(zhǎng)。

2.1.3.2 黃原膠 + 聚乙烯醇 + 醋酸酯淀粉 + 水楊酸配方 醋酸酯淀粉（AS）是一種黏度高，澄明度高，凝沉性弱，儲(chǔ)存穩(wěn)定的疏水性淀粉。將造粒直徑固定在8 mm，使用4%PVA溶液粘合造粒。由圖5可以看出，隨著醋酸酯淀粉加入的比例增加，最終水楊酸釋放率先上升后下降，最高的是XG∶AS∶SA = 3∶1∶1。各比例對(duì)釋放持續(xù)時(shí)間的影響差異不明顯，釋放持續(xù)約2.5 天。

圖 4 含不同XG∶SA比例的緩釋顆粒中水楊酸隨浸泡時(shí)間的釋放率(D=8 mm, 4% PVA)Fig. 4 Release percentage of SA in prepared slow-release granules containing different XG∶SA ratio with soaking time ( D=8 mm, 4% PVA)

圖 5 含不同XG∶AS∶SA比例的緩釋顆粒中水楊酸隨浸泡時(shí)間的釋放率(D=8 mm, 4% PVA)Fig. 5 Release percentage of SA in prepared slow-release granules containing different XG∶AS∶SA ratio with soaking time (D=8 mm, 4% PVA)

2.1.3.3 黃原膠 + 聚乙烯醇 + 硬脂酸 + 水楊酸配方將造粒直徑固定在8 mm，使用4%PVA溶液粘合造粒，分別制作XG∶硬脂酸∶SA比例為1∶1∶1、2∶1.5∶1、3∶0.5∶1、2∶2∶1、3∶1∶1 的緩釋顆粒，緩釋顆粒中水楊酸隨浸泡時(shí)間的釋放率變化如圖6所示。從圖中可以看出，隨著硬脂酸加入比例的上升，釋放持續(xù)的時(shí)間先增長(zhǎng)后減短，轉(zhuǎn)折點(diǎn)在XG∶硬脂酸∶SA比例為1∶1∶1的顆粒，該配方制成的緩釋顆粒對(duì)SA的釋放時(shí)間可以持續(xù)約3 天。最終水楊酸釋放率隨著硬脂酸加入比例的上升呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。對(duì)水楊酸含量相同、黃原膠和硬脂酸含量不一樣的配方的釋放行為進(jìn)行對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，硬脂酸含量越多，水楊酸釋放受到的抑制越強(qiáng)，有利于在更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)緩釋。綜合來(lái)看，XG∶硬脂酸∶SA = 1∶1∶1，D = 8 mm，4%PVA造粒時(shí)緩釋效果最好，可持續(xù)約3 天。

圖 6 含不同XG∶硬脂酸∶SA比例的緩釋顆粒中水楊酸隨浸泡時(shí)間的釋放率(D=8 mm, 4% PVA)Fig. 6 Release percentage of SA in prepared slow-release granules containing different XG: stearic acid∶SA ratio with soaking time (D=8 mm, 4% PVA)

2.1.3.4 黃原膠 + 聚乙烯醇 + 殼聚糖(CS) + 水楊酸配方 不同XG∶CS∶SA比例所制成的緩釋顆粒中水楊酸的釋放率隨浸泡時(shí)間的變化曲線如圖7所示。以外形觀察結(jié)果來(lái)看，只有殼聚糖加入最少的XG∶CS∶SA = 3∶0.5∶1配方有較明顯的溶脹行為，且較早釋放結(jié)束，其他配方則一直保持丸狀的基本形狀，釋放也較慢。隨著殼聚糖加入比例的上升，釋放持續(xù)時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，XG∶CS∶SA = 1∶1∶1和2∶1.5∶1(殼聚糖含量相同)時(shí)最遲，但由于殼聚糖成本較高，綜合考慮還是選擇XG∶CS∶SA =3∶1∶1的配比，所制成的緩釋顆粒釋放時(shí)間可以持續(xù)約4 天。

圖 7 含不同XG∶CS∶SA比例的緩釋顆粒中水楊酸隨浸泡時(shí)間的釋放率(D=8 mm, 4% PVA)Fig. 7 Release percentage of SA in prepared slow-release granules containing different XG∶CS∶SA ratio with soaking time (D=8 mm, 4% PVA)

2.2 優(yōu)化配方的土柱淋溶試驗(yàn)

試驗(yàn)方法同前文。選取優(yōu)化所得的配方(XG∶CS∶SA = 3∶1∶1，D = 8 mm，4% PVA)所制成的緩釋顆粒進(jìn)行土柱淋溶試驗(yàn)，釋放曲線如圖8所示，持續(xù)了約36 天。

同樣配方的緩釋顆粒在土中的釋放比在水中慢很多，這是因?yàn)樵谕林蓄w粒不會(huì)一直保持被水浸泡的狀態(tài)，得以緩慢地釋放內(nèi)容物，其結(jié)果比靜水浸出試驗(yàn)更具參考價(jià)值。

3 討論

根據(jù)靜水浸出試驗(yàn)結(jié)果分析，粗粒徑的黃原膠溶解更緩慢，對(duì)內(nèi)容物的釋放也會(huì)更慢。緩釋顆粒直徑較小時(shí)最終釋放的百分比更高但由于比表面積大釋放也更快，顆粒過(guò)大時(shí)最終釋放的百分比會(huì)降低且持續(xù)時(shí)間也不會(huì)延長(zhǎng)。

圖 8 土柱淋溶法測(cè)量的緩釋顆粒中SA的累計(jì)釋放量隨掩埋時(shí)間的變化Fig. 8 Cumulative release of SA with buried time measured with soil column leaching method

根據(jù)土柱淋溶試驗(yàn)結(jié)果，醋酸酯淀粉作為無(wú)毒無(wú)害可降解的疏水性材料，其加入使制成的緩釋顆粒在水中的釋放持續(xù)效果比XG + PVA + SA配方延長(zhǎng)了2 天左右，且醋酸酯淀粉本身較廉價(jià)，也有相關(guān)研究證實(shí)其緩釋作用[15-16]，配方較為可行。

加入硬脂酸制成的緩釋顆粒的釋放持續(xù)時(shí)間相比加入醋酸酯淀粉的配方延長(zhǎng)約3 天，但硬脂酸的自然降解很少有文獻(xiàn)涉及，僅有一篇在自然環(huán)境中篩選出硬脂酸降解菌的相關(guān)文獻(xiàn)[17]，因此硬脂酸雖然無(wú)毒且在醫(yī)藥片劑中有所應(yīng)用[18-19]，但在土壤中難以降解，該配方并不理想。

殼聚糖在緩釋材料方面的應(yīng)用早有研究[9]，且殼聚糖具有吸附土壤中重金屬、凈化水質(zhì)、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、誘導(dǎo)植物抗病性、改善土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)等作用[20-24]，因此在配方中加入殼聚糖對(duì)土壤、水環(huán)境無(wú)害。且殼聚糖(CS)在溶液環(huán)境中分子帶有正電荷，與分子帶負(fù)電荷的黃原膠和水楊酸混勻，可以以電荷的吸引作用來(lái)延長(zhǎng)釋放效果，試驗(yàn)結(jié)果也顯示這個(gè)方向有一定效果。在加入殼聚糖的配方制成的緩釋顆粒中，雖然殼聚糖比例越高緩釋顆粒的釋放持續(xù)時(shí)間會(huì)越長(zhǎng)，但當(dāng)殼聚糖使用過(guò)多時(shí)持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)效果相較于成本的提升并不理想，綜合考慮成本和緩釋效果，選擇XG∶CS∶SA = 3∶1∶1，D= 8 mm，4%PVA造粒的配方較好，在水中持續(xù)時(shí)間約4 天，高峰期在前2.5 天，在土柱中則可以達(dá)到36 天，是本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的配方所制成的緩釋顆粒中釋放持續(xù)時(shí)間最久的。該配方制成的緩釋顆粒在土柱中的緩釋效果較接近本研究的預(yù)期效果，還需進(jìn)一步研究pH值、鹽離子環(huán)境、溫度等條件對(duì)緩釋顆粒的釋放行為造成的影響。

4 結(jié)論

經(jīng)過(guò)優(yōu)化，以黃原膠為主要基質(zhì)的緩釋顆粒中，水楊酸的釋放在前60 h快速增長(zhǎng)，60～80 h為轉(zhuǎn)折點(diǎn)，之后趨于平緩。優(yōu)化配方為黃原膠∶殼聚糖∶水楊酸質(zhì)量比例為3∶1∶1，造粒直徑8 mm，以4% PVA溶液進(jìn)行粘合造粒，混合粉末與粘合劑重量比為1.1∶1，所得的緩釋顆粒在去離子水中釋放時(shí)間可持續(xù)約4 天，高峰期在前2.5 天，在土柱中則可以持續(xù)36 天，較為成功。該體系使用材料成本較低、無(wú)污染、易操作，拓寬了黃原膠的應(yīng)用范圍并提供了一種不需要復(fù)雜操作的緩釋系統(tǒng)制作方法。