藍莓采后灰霉病病原鑒定及肉桂皮精油對其抑制作用

王丹　辛力　張靜　楊娟俠　翟浩　董成虎

摘 ? ?要：為明確山東泰安本地藍莓采后果實灰霉病及肉桂精油對其的抑菌效果，本研究從自然發病的藍莓果實上分離菌株，采用傳統真菌形態學、rDNA-ITS 序列分析，結合構建系統進化發育樹進行鑒定，并通過體外熏蒸抑菌試驗研究肉桂精油的抑菌效果。結果表明，該病原菌為灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）。肉桂皮精油對灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）的最低抑菌濃度MIC及最小殺菌濃度MFC分別為0.03 μL·mL-1和0.09 μL·mL-1。

關鍵詞：藍莓;灰霉病;肉桂精油;體外熏蒸

中圖分類號：S663 ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.05.014

Identification of Gray Mold Rot Pathogen on Blueberry Fruit and Inhibitory Effect of Cinnamon Bark Oil

WANG Dan1， XIN Li1， ZHANG Jing1， YANG Juanxia1， ZHAI Hao1， DONG Chenghu2

（1.Shandong Institute of Pomology， Tai'an， Shandong 271000，China;2.National Engineering and Technology Research Center for Preservation of Agricultural Products， Tianjin Key Laboratory of Postharvest Physiology and Storage of Agricultural Products， Tianjin 300384， China）

Abstract： The study was aimed to identify gray mold rot pathogen in postharvest blueberry， in Taian， Shandong province and the antifungal effect of cinnamon oil. Based on traditional morphological identification method， rDNA-Internal transcribed spacer （ITS） analysis and phylogenetic tree， the strain was identified as Botrytis cinerea. Cinnamon bark oil exhibited obvious antifungal effect on Botrytis cinerea， and the MIC and MFC were 0.03 μL·mL-1 and 0.06 μL·mL-1， respectively.

Key words： blueberry; gray mold rot; cinnamon oil; in vitro fumigation

藍莓（Vaccinium）屬杜鵑花科、越橘屬植物，其果實富含多酚類、有機酸類、糖類、礦物質類等營養成分[1-2]，具有營養保健作用，受到越來越多消費者的青睞。但藍莓果實含水量高，果皮較薄，采收多在高溫高濕季節，采前及貯運過程中潛伏的微生物容易在采后適宜的條件下集中發病，最終導致果實腐爛變質，喪失其商品性[3-4]。

灰霉病是藍莓果實上的主要病害，對產量影響較大，且全國各個藍莓產區均有發生[5]。戴啟東等[6]對藍莓灰霉病的病原菌進行了鑒定，確定為灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea），但此研究主要取自栽培期間病果和病葉，而且僅采用傳統真菌形態學的鑒定方法。隨著分子生物學的技術的發展，rDNA-ITS 序列分析被廣泛應用于植物病原真菌鑒定、分類和系統發育研究[7-8]。

植物精油是一種植物源天然殺菌劑，在保鮮領域的應用越來越受到關注。肉桂精油主要功能成份肉桂醛含量在75%以上，殺菌、抗氧化功能顯著[9]。有研究表明，肉桂精油對葡萄、番茄、芒果采后貯藏有明顯的保鮮效果[9-11]，但其在藍莓采后灰霉病控制方面的研究鮮有報道。

本試驗對山東泰安產區藍莓采后貨架期灰霉病發病果實分離到的微生物進行分離純化，采用傳統真菌形態學結合菌株ITS序列分析，對所分離到的菌株進行鑒定，分析確定病原菌種屬。選用肉桂精油進行體外抑菌試驗，為藍莓采后貨架期灰霉病的生物防治提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

果實：‘晚豐藍莓，2018年6月21日采自山東省泰安市良莊鎮藍莓合作社，當日運至實驗室，挑選顏色大小均勻、無病蟲害、無機械傷的健康果實于（25±1） ℃ 條件下放置，待自然發病后進行病原菌的分離鑒定。

試劑：肉桂精油，購自廣州恒信香料有限公司，濃度為85%。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（ PDA）購自上海盛思生物科技有限公司。

儀器：ChamlGel 6000全自動凝膠成像分析系統 SAGE CREATION;GR110DR 全自動高壓滅菌鍋 ZEALWAY;SPX-320生化培養箱 寧波江南儀器廠;S1000 PCR儀 BioRad;PowerPac Basic 電泳儀 BioRad;3730XL全自動DNA測序儀 Applied Biosystems。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離純化 采用常規組織分離法，從自然發病的藍莓果實病健處切取約2 mm組織，用75%醫用酒精表面消毒30 s，無菌水沖洗孢子接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）上，25 ℃恒溫培養。經3～5次劃線分離，直至獲得純培養物[12]。

1.2.2 菌株形態學鑒定 將純化后的菌株接種于PDA培養基，培養一段時間，觀察菌落培養性狀，包括菌落形狀、顏色，菌絲長度、致密性等;挑取菌絲制片，顯微鏡觀察分生孢子的大小、形狀、顏色等特征。

1.2.3 致病性檢測 根據柯赫氏法則進行致病性檢測。取菌落邊緣直徑為5 mm的菌餅，采用針刺法將菌餅接種于已消毒果實被刺傷部位。以接種無菌的PDA培養基塊作為對照，在25 ℃溫度條件下培養7 d后觀察發病情況。每種病原菌處理3個重復，每個重復15個果實。發病后于病斑處再次分離培養病原菌，與原接種菌株對比，形態學鑒定一致則確定為該病原菌。

1.2.4 病原菌分子生物學鑒定 利用CTAB提取菌株DNA，選用真菌通用引物 ITS1和ITS4對病原菌進行PCR 擴增。

引物序列：ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGC

GG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）

擴增程序：94 ℃ 變性 5 min;94 ℃ 40 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35個循環;72 ℃延伸10 min。

PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由鉑尚生物技術（上海）有限公司進行測序，測序結果在NCBI 數據庫中進行 BLAST 比對分析，搜索同源性較高的已知序列，用 DNAMAN 軟件對已知序列計算相似性;利用MEGA 5.2 軟件以 NJ（Neighbor-Joining）法構建系統發育樹。

1.2.5 肉桂精油對病原菌的體外抑菌試驗 選擇61 mL（直徑75 mm）的培養皿，取一片直徑為30 mm的濾紙貼在皿蓋中央，與培養皿一同滅菌后使用。倒入PDA培養基后，用無菌打孔器取直徑7 mm的病原菌菌餅接入，分別取一定量的肉桂精油滴于濾紙片中央，使其體積含量分別為0.030，0.060，0.090 μL·mL-1，不加精油的為對照組。于25 ℃溫度條件下培養4～5 d，采用十字交叉法測量菌落直徑并計算抑菌率。以48 h內抑制率100%的最低精油濃度為其最低抑菌濃度（Minimal Inhibitory Concentration， MIC），繼續培養48 h，若仍不長菌，則為最小殺菌濃度（Minimal Fungicidal Concentration， MFC）。每個濃度梯度重復4次。

抑菌率（%）=[（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）]× 100

1.3 數據分析

采用SPSS 19.0對數據統計分析，采用Duncan's 多重比較進行顯著性分析，P<0. 05 作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離及鑒定

在PDA培養基上（圖1a），菌絲初為白色絨狀，然后顏色變為淺褐色，形成黑色菌核。分生孢子（圖1b）數根叢生，直立或稍彎曲，具隔膜，頂端呈1～2次分枝，分枝的末端膨大，上密生小梗，小梗上聚生大量分生孢子。分生孢子卵圓形、橢圓形，無色至淡褐色，單孢，（8.3～11.3） μm×（6.3～10.1） μm。

將分離純化的菌株采用穿刺法接種于藍莓健康果實，3～5 d癥狀顯現，7 d后發病嚴重，與原發病狀較一致，重新分離后，其培養性狀與原菌株相同，而對照處理不發病（圖1c）。根據柯赫氏法則，確定該病原菌為灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）。

將菌株ITS全序列在GenBank數據庫中進行同源比對，與其相似序列用MEGA 5.2軟件的最大似然法（Maximum Likelihood， ML）構建系統發育樹，以明確病原菌分類地位。

從圖2中看出，菌株G與意大利（寄主不詳）灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）（KT587323.1）、美國（寄主不詳）富氏葡萄孢盤菌（Botryotinia fuckeliana）（AY544695.1）、愛沙尼亞的寄生樺木的蠟盤菌（Rutstroemia firma）（KX138402.1）聚在同一枝。結合孢子形態特征，將分離自藍莓灰霉發病部位菌株鑒定為灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）。

2.2 肉桂精油對Botrytis cinerea的體外抑菌效果

以體外熏蒸的抑菌試驗觀察不同濃度肉桂精油對灰葡萄孢霉菌絲生長延伸量的抑制作用，如圖3所示，0.03 ～0.09 μL·mL-1濃度范圍內，隨濃度增大，抑菌活性增強。0.06 μL·mL-1和0.09 μL·mL-1這2個濃度在培養72 h內，均未見菌絲生長和蔓延，抑菌率為100%。在濃度0.09 μL·mL-1時，144 h內抑菌率均達100%，0.06 μL·mL-1濃度下，144 h 內抑菌率基本在80%以上，而在0.03 μL·mL-1濃度下，72 h內抑菌活性相對較強，培養120 h后，抑菌率即降至52.12%，120 h后，基本沒有抑制效果。肉桂皮精油對灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）的最低抑菌濃度MIC及最小殺菌濃度MFC分別為0.03 μL·mL-1和0.06 μL·mL-1。

3 結論與討論

經形態學鑒定、rDNA-ITS序列分析及回接試驗證實，山東泰安產區‘晚豐藍莓采后果實灰霉病是由灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）引起。肉桂精油對灰葡萄孢霉體外熏蒸抑菌效果顯著，最低抑菌濃度MIC及最小殺菌濃度MFC分別為0.03 μL·mL-1和0.09 μL·mL-1。陳倩茹等[13]通過觸殺方式測定了香茅精油對灰葡萄孢完全抑制效果的濃度為1.5 μL·mL-1，與本試驗肉桂皮精油的有效濃度相差10倍以上，筆者分析這與精油的類型有一定關系，但最主要原因還是作用方式的不同，觸殺用量要遠高于熏蒸處理。這與施俊鳳等[14]研究較為一致，其結果為百里香精油通過熏蒸和直接接觸作用對番茄灰霉病的抑制濃度分別為0.1 μL·mL-1和1.6 μL·mL-1，但精油具體的抑菌機制有待進一步闡明。

參考文獻：

[1]Castrej ?n ?A D R， Eichholz I， Rohn S， et al. Phenolic profile and antioxidant activity of highbush blueberry（Vaccinium corymbosum L.） during fruit maturation and ripening[J]. Food chemistry，2008，109（3）：564-572.

[2]ZAFRA-STONE S， YASMIN T， BAGCHI M， et al. Berry anthocyanins as novel antioxidants in human health and disease prevention[J]. Mol nutr food res， 2007， 51： 675-683.

[3]PERKINS-VEAZIE P， COLLIN J K， HOWARD L. Blueberry fruit response to postharvest application of ultraviolet radiation[J]. Postharvest biology and technology， 2008， 47（3）：280-285.

[4]鄭永華.高氧處理對藍莓和草莓果實采后呼吸速率和乙烯釋放速率的影響[J].園藝學報， 2005， 32（5）：866-868.

[5]周福慧， 姜愛麗， 姬亞茹， 等. 納他霉素對采后藍莓果實灰霉病防治[J].食品工業科技， 2018， 39（8）：257-260， 317.

[6]戴啟東， 李廣旭. 藍莓灰霉病病原鑒定和生物學特性研究[J]. 中國果樹， 2011（3）：46-48.

[7]ODONNELL K， CIGELNIK E. Two divergent intragenomic rDNA ITS2 types within a monophyletic lineage of the fungus Fusarium are nonorthologous[J]. Molecular phylogenetics and evolution， 1997， 7：103-116.

[8]MARMEISSE R， DEBAUD J C， CASSELTON L A. DNA probes for species and strain identification in the ectomycorrhizal fungus Hebeloma[J]. Mycological research， 1992， 96：161-165.

[9]呂明珠， 于爽， 朱恩俊. 肉桂精油對紅提葡萄保鮮效果的影響[J].食品科學， 2016， 37（6）： 272-277.

[10]張娜娜， 張輝， 馬麗， 等. 肉桂醛對番茄采后灰霉病的抑制作用及其對品質的影響[J].食品科學， 2014， 35（14）： 251-255.

[11]柳風， 詹儒林， 何衍彪， 等. 抑菌物質肉桂醛防治杧果炭疽病機制研究[J].果樹學報， 2011， 28（4）： 651-656.

[12]解淑慧， 邵興鋒， 王可， 等. 柑橘采后腐爛主要致病菌的分離鑒定及丁香精油對其抑制作用研究[J]. 果樹學報， 2013， 30（1）： 134-139，181.

[13]陳倩茹， 徐仕翔， 余挺， 等. 香茅精油體外和體內對櫻桃番茄致病菌灰葡萄孢的抑制性研究[J]. 中國食品學報， 2014， 14（10）： 49-54.

[14]施俊鳳， 孫常青， 王瀟冉， 等. 番茄采后病原鑒定及百里香精油生物活性研究[J]. 中國食品學報， 2016， 16（2）： 224-232.