運用DNA條形碼技術鑒定茶園蜘蛛物種

邢樹文 孫延杰 朱慧 查廣才

摘要運用DNA條形碼技術， 對廣東潮州茶園蜘蛛物種進行了分子鑒定。本研究利用基因測序技術獲取了鳳凰山區域茶園50種蜘蛛的74條線粒體細胞色素C氧化酶亞基I （mitochondrial cytochrome C oxidase subunit Ⅰ， COⅠ） 基因序列。使用鄰接法 （neighbor joining， NJ） 構建系統發育樹， 運用ABGD（automatic barcode gap discovery）軟件對蜘蛛樣本進行聚類分析。結果表明： 鄰接法構建的系統發育樹聚類結果與ABGD軟件劃分結果以及形態分類鑒定結果相一致， 運用DNA條形碼可以有效地對蜘蛛物種進行分子鑒定。這對茶園蜘蛛疑難物種和新物種的鑒定具有重要意義， 在茶園蜘蛛物種多樣性的研究中也具有重要價值。由此表明， 基于COⅠ基因的DNA條形碼對于本研究中所涉及的蜘蛛物種的劃分具有較好的區分結果， 可以作為一種有效的工具在茶園蜘蛛物種鑒定中進行應用。

關鍵詞蜘蛛;分子鑒定;系統發育樹;ABGD

中圖分類號：Q 959.226.2

文獻標識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2018131

茶園病蟲害的生態防控是實現鳳凰單叢茶可持續發展的有效途徑之一。蜘蛛是農林業害蟲重要的捕食性天敵， 是調控蟲害的重要生態因子[1]。因此，深入研究保護茶區的蜘蛛物種多樣性至關重要。傳統的形態學分類已有250多年的歷史，全世界蜘蛛已知近47 000種[1]，我國僅記錄蜘蛛4 282種[2]，還有大量的物種沒有發現。傳統蜘蛛分類的方法是依據蜘蛛身體外部形態及其生殖器結構的差異區分物種， 但對于體形、大小、體色相似的蜘蛛物種， 或因區域環境變化引起的種內個體差異， 及處于不同發育階段的幼蛛， 僅依靠形態特征難免會鑒定錯誤[3]， 這也是傳統分類學鑒定物種受限的原因。自從加拿大科學家Hebert等[4]提出把DNA條形碼應用到生物物種鑒定之后， DNA條形碼就成為了分類學研究的熱點， 尤其在動物物種鑒定上發展迅猛。動物線粒體基因重組率低， 進化速率較快， 且大多數物種COⅠ基因可以使用通用引物進行擴增。 Hebert等利用一段658 bp標準化的COⅠ基因片段對動物進行DNA序列分析，并準確地對動物物種進行了分子鑒定[5]。由此表明， 利用COⅠ基因片段對蜘蛛物種進行分子鑒定具有一定的可行性。國內學者對利用DNA條形碼進行物種分類的研究起步較晚，對蜘蛛的分子鑒定研究也較少，如，王麗艷對環京津地區的平腹蛛科[6]、劉娜對我國西南地區狼蛛科和漏斗蛛科[7]、曹瀟巍對中國擬遁蛛屬[8]及何靜超等對河北小五臺山蟹蛛科[9]進行了DNA條形碼的分類研究。因此，我國蜘蛛分類學家DNA條形碼序列基因庫的建設和完善還任重道遠。蜘蛛分布廣， 適應性強， 其形態與體型易受環境變化的影響，因此，傳統形態學分類方法對一些隱存種、相近種的雌雄配對， 以及對處于不同發育期的幼蛛的分類鑒定有一定困難， 而運用DNA條形碼技術可以解決傳統分類上存在的疑難問題。本研究選用分布于鳳凰山茶區的50種蜘蛛74個樣本作為試驗材料， 利用線粒體COⅠ基因片段構建基于分子數據的系統發育樹，探索了DNA條形碼技術對鳳凰山茶區蜘蛛物種鑒定的準確性， 對明確鳳凰單叢茶區的蜘蛛資源及蜘蛛物種的多樣性具有重要意義。該成果將填補鳳凰山茶區蜘蛛分類學及其多樣性研究的學科空白， 同時對該茶區生境的保護與評價、蜘蛛資源在生物防治中的應用等具有積極意義。

1材料與方法

1.1標本采集及形態鑒定

本研究所用的蜘蛛樣本采集于潮州鳳凰山茶區不同海拔高度的茶園，包括鳳凰鎮橋頭村茶園（海拔360 m）、上春村茶園和芼嶺村茶園（海拔520 m）、叫水坑村茶園（海拔690 m）和天池茶園（海拔930 m）。本次測序使用了50種蜘蛛的74個樣本， 測序前使用形態學分類的方法對蜘蛛樣本進行物種鑒定，蜘蛛分類結果如表1所示。

1.2DNA提取與PCR擴增

DNA提取采用Sambrook等[10]和楊聰慧等[11]的方法， 利用Animal tissue Genomic DNA Kit提取蜘蛛總DNA，操作步驟依照試劑盒的操作說明進行。提取的總DNA用瓊脂糖電泳檢測后置于-80℃冰箱保存、備用。采用Folmer等[12]的方法，使用通用引物LCO1490（5′GGTCAA CAAATCATAAAGATATT GG3′）和HCO 2198（5′TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA3′）對供試的74個蜘蛛樣本進行線粒體COⅠ基因擴增， 擴增片段的長度約為680 bp。PCR擴增體系[13]為25 μL： MasterMix 12.5 μL， LCO1490 （10 μmol/L）＼HCO 2198（10 μmol/L）各0.8 μL， ddH2O 8.9 μL， DNA模板2.0 μL。PCR擴增的反應條件為：94℃預變性5 min;35個循環，94℃預變性30 s，45℃退火40 s，72℃延伸1 min;-20℃保存。

1.3數據分析

1.3.1DNA序列的比對

PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測， 上樣量為2 μL， 電壓100 V， 在UVP凝膠成像系統下觀察和拍照。擴增結果良好（約700 bp有單一的亮帶）的PCR產物， 委托蘇州金唯智生物科技有限公司進行雙向測序。測序結果以Chromas軟件判斷基因測序峰圖質量， 人工校對堿基， 確定COⅠ基因片段序列的正確性，以DNASTAR 6.0軟件中的子程序SeqMan拼接雙向測序結果， FASTA格式輸出，采用Clustal X軟件[1314] 對最終校對確認的DNA序列進行多重序列比對分析。

1.3.2系統發育樹的構建與遺傳距離的計算

利用MEGA 6.0軟件， 采用雙參數模型（Kimura 2parameter， K2P）[16]計算各分類單元之間的種間遺傳距離，同時分析其序列的堿基組成情況及密碼子的使用率。畫出頻率分布直方圖， 進行“barcoding gap”[17]分析。以盲蛛序列作為外群， 鄰接法（neighbor joining， NJ）構建蜘蛛的系統發育樹， 并進行內部分支檢驗與1 000次bootstrap檢驗分析， 確定各支系的置信度。如果在進化樹上同一個物種能聚成一個單系， 則認為NJ分子系統發育樹能將此物種與其他物種區分開， 反之則不能區分開。

1.3.3ABGD的劃分

使用ABGD（automatic barcode gap discovery）軟件[18]， 基于遺傳距離劃分樣本， 劃分在同一組的樣本被認定屬于同一物種。本試驗將50種蜘蛛74個樣本的K2P遺傳距離矩陣在線提交到ABGD網站（http：∥wwwabi.snv.jussieu.fr/public/abgd/）， P（prior intraspecific divergence）設為0.001～0.1， 最小相對gap寬度值X（minimum relative gap width）為1.0， 然后將樣本劃分結果與形態鑒定結果比較對照。

2結果與分析

2.1COⅠ基因堿基組成

利用MEGA 6.0軟件[15]對50種蜘蛛COⅠ基因的74條序列和1個外群2條序列進行堿基組成分析， 結果見表2。T、C、A、G的平均含量分別為42.3%、13.1%、26%和18.7%，A+T含量為68.3%，有明顯的AT偏向性。蜘蛛COⅠ基因各位點堿基組成頻率及替換型式， 如表3所示。平均堿基相同位點為434個， 平均轉換數為39個， 平均顛換數為55個， 平均顛換與轉換比為0.72; 顛換主要以AT為主， 轉換主要以TC為主。

2.2基于P距離的堿基替換飽和性分析

DNA的堿基替換類型有轉換（transition， TS）和顛換（transversion， TV）兩種類型。本研究對50種蜘蛛74個樣本進行DNA 條形碼序列擴增分析， 以TS和TV為縱坐標，以遺傳距離為橫坐標，建立二維坐標圖用以估計DNA序列堿基飽和度狀況。圖1顯示，TS、TV隨著P距離的增加而線性增加， 未表現出飽和態勢， 說明鳳凰山區茶園的蜘蛛有很強的系統發育信號， 堿基的位點及置換關系均可用于分析和解釋蜘蛛的系統發育， 見圖1。

2.3系統發育樹聚類結果

本試驗中， 對74頭蜘蛛樣本采用鄰接法， 以2條盲蛛目的COⅠ序列為外群構建鳳凰山茶區蜘蛛群落的NJ系統發育樹， 聚類結果如圖2所示。聚類結果表明， 外群兩種盲蛛與50種蜘蛛被劃分為姐妹群，74個蜘蛛樣本聚類后沒有出現物種交叉的現象， 50種蜘蛛各自聚成一個單系群， 不同蜘蛛被明顯區分。NJ樹中顯示， 除白觸斑蛛Euophrys albopopdis外， 其余不同種蜘蛛的支持率均超過90%以上。

2.4遺傳距離與ABGD劃分結果分析

以K2P模型計算50種蜘蛛COⅠ序列的種間遺傳距離結果表明，522條序列的種間平均距離為0.02～0.229，其中，黑斑蓋蛛Neriene nigripectoris與皮氏紅螯蛛Chiracanthium pichoni之間的平均遺傳距離最大，為0.229，突尾艾蛛Cyclosa conica與濁斑艾蛛Cyclosa confusa、日本艾蛛Cyclosa japonica之間平均遺傳距離最小，為0.02。74個蜘蛛樣本序列依據 1%的序列差異被分為50組。其中，除白觸斑蛛Euophrys albopopdis兩個樣本不支持該物種外， 其余蜘蛛物種全部一一對應，DNA條形碼分子鑒定與形態學鑒定的結果吻合度為98%（49/50）。

本試驗對74個蜘蛛樣本（包含外群）的ABGD劃分結果包括初始劃分（initial partition）和遞歸劃分（recursive partition）兩種情況。遞歸劃分較為穩定， 遺傳距離在0.001～0.1之間， 包括外群在內的74個蜘蛛樣本被分成50組， 支持50個蜘蛛物種（見圖3）。而初始化分結果在0.001～0.001 7之間， 被分成42.67組，支持42.67個蜘蛛物種; 遺傳距離在0.002 8～0.004 6之間， 被劃分為48組; 遺傳距離在0.007 7～0.100 0之間，被劃分為50組。遺傳距離在42.67～50.00之間，P值范圍浮動較大，不夠穩定， 而遞歸劃分較為穩定， 包括外群在內的74個蜘蛛樣本被分成50組， 與形態學的鑒定結果吻合度較高（表4）。ABGD的劃分結果與NJ樹呈現對應關系， 每個 ABGD的劃分結果NJ發育樹上均已標明， 如圖2所示。

3討論

本研究以鄰接法與通用引物對鳳凰山茶園的74個不同種類的蜘蛛樣本構建NJ系統發育樹， 74個樣本1%的COⅠ序列利用ABGD分成了50組， DNA條形碼技術的分子鑒定結果中， 只有白觸斑蛛不支持形態學鑒定結果， 其余蜘蛛物種的分子鑒定與形態學鑒定結果高度吻合。分子閾值分類結果與形態學鑒定的誤差只有2.00%， 證明了DNA條形碼技術對物種進行分子鑒定的有效性。除白觸斑蛛外， 每個蜘蛛物種聚類明顯， 沒有出現物種交叉現象， 并且均各自聚成一個單系群， 且各單系分支的支持率均超過90%， COⅠ序列在鳳凰山茶園蜘蛛的鑒定中準確性較高， 表明本研究的DNA條形碼可以作為鳳凰山蜘蛛鑒定的重要數據。

ABGD方法是基于一定范圍的先驗值P自動探測給定數據集的“barcoding gap”[1920]， 在一定程度ABGD減少了閾值定義的人為因素， 降低了基于最小距離法分類法界定的主觀性， 并且具有較高的準確性。本研究中運用ABGD軟件對鳳凰山蜘蛛74個樣本進行分組劃分， 結果與傳統形態學分類鑒定的結果完全一致， 本研究初步評估了鳳凰山茶區蜘蛛物種的多樣性[21]， DNA條形碼技術為該茶區蜘蛛分類學、生態學及相關研究開拓了物種分類新的研究領域和更具備前沿技術的新方法， 為保護和恢復該茶區蜘蛛種群提供了可靠依據[22]。但對一些動物分化期較短的物種， 因其極小的種內遺傳距離， 從而導致基于進化樹和遺傳距離的條形碼技術不能準確鑒定這些物種。因此， DNA條形碼技術在眾多物種鑒定中還需要大量試驗的驗證， 才能更好地完善其在更多生物物種分類上的應用。自然界中生物因地理區域分布、環境及氣溫等各種因素的影響，物種分化期和進化速率不同， 只依靠DNA 條形碼技術還不能完全區分自然界中千變萬化的生物物種。因此， 運用DNA序列的分析對蜘蛛進行分子鑒定必須結合傳統的形態分類學方法， 才是快捷、準確鑒定蜘蛛物種的科學方法[23]， 脫離傳統分類學而開展DNA條形碼研究不可能取得科學準確的成果[2425]。由于蜘蛛存在潛在的新種、隱存種或復合種， 因此， 對蜘蛛物種進行單分子標記是DNA條形碼技術應用的關鍵， 對某一蜘蛛選擇特征性的基因片段與其COⅠ序列共同作為DNA條形碼的標記基因， 對這些疑難種進行分子鑒定才能獲取更高的正確率[26]。在本研究中， 由于受到采集時間、地理區域等因素的限制， 采集的蜘蛛樣本數量偏少， 從而凸顯所鑒定的蜘蛛物種代表性欠缺。我們在以后的研究中， 將補充各季節和不同海拔、不同環境茶區的蜘蛛標本， 采集更多的茶區蜘蛛DNA條形碼序列的數據， 初步構建一個較為完整的鳳凰山茶區蜘蛛條形碼數據庫。

參考文獻

[1]PLATNICK N I. The world spider catalog， version 13.5 [DB/OL]. （20130506）[2018522]. http：∥research. amnh. org/iz/spiders/catalog/INTRO1. html.

[2]李樞強，林玉成. 中國生物物種名錄. 第3卷. 動物. 無脊柱動物1[M].北京：科學出版社，2015.

[3]PADIAL J M， MIRALLES A， DE lA RIVA I， et al. The integrative future of taxonomy[J]. Frontiers in Zoology， 2010， 7（1）：16.

[4]HEBERT P D N， CYWINSKA A， BALL S L， et al. Biological identifications through DNA barcodes[J]. Proceedings of the Royal Society B：Biological Sciences，2003，270：313321.

[5]HEBERT P D N， RATNASINGHAM S， DEWAARD J R. Barcoding animal life： cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species[J]. Proceedings of the Royal Society B： Biological Sciences， 2003， 270： S96S99.

[6]王麗艷.環京津地區平腹蛛分類及DNA條形碼研究[D].保定： 河北大學， 2016.

[7]劉娜. 狼蛛科和漏斗蛛科擬隙蛛屬蜘蛛DNA條形碼研究[D]. 重慶： 西南大學， 2015.

[8]曹瀟巍. 基于形態與生物條形碼的中國擬遁蛛屬（Pseudopoda Jger， 2000）蜘蛛分類學研究（蜘蛛目： 蟹蛛科）[D].武漢： 湖北大學， 2016.

[9]何靜超，胡嵐嵐，郭晨輝，等.小五臺山蟹蛛DNA條形碼分子鑒定[J].河北大學學報（自然科學版），2016，36（3）：286292.

[10]SAMBROOK J F， FRITSCH E F， MANIATIS T. Molecular cloning， a laboratory manual[M]. 2nd ed. New York， Cold Spring Harbor： Laboratory Press， 1989.

[11]楊聰慧， 金倩， 陳付強， 等. 基于進化樹、距離和特征的DNA條形碼方法研究——以百花山地區草螟科為例[J]. 應用昆蟲學報， 2013， 50（1）： 6170.

[12]FOLMER O， BLACK M， HOEH W， et al. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunitⅠfrom diverse metazoan invertebrates [J].Molecular Marine Biology & Biotechnology， 1994， 3（5）： 294299.

[13]楊聰慧， 韓輝林， 遲美妍， 等. DNA條形碼技術在北京百花山地區夜蛾科物種鑒定中的應用[J]. 昆蟲學報， 2012， 55（9）： 10821092.

[14]LARKIN M A， BLACKSHIELDS G， BROWN N P， et al. Clustal W and Clustal X version 2.0 [J]. Bioinformatics， 2007， 23（21）： 29472948.

[15]TAMURA K， STECHER G， PETERSON D， et al. MEGA6： molecular evolutionary genetics analysis version 6.0 [J]. Molecular Biology and Evolution， 2013， 30： 27252729.

[16]KIMURA M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences [J]. Journal of Molecular Evolution， 1980， 16（2）： 111120.

[17]MEYER C P， PAULAY G. DNA barcoding： error rates based on comprehensive sampling [J/OL].PLoS Biology，2005，3（12）：e422.DOI：10.1371/Journal.pbio.0030422.

[18]PUILLANDRE N， LAMBERT A， BROUILLET S， et al. ABGD， automatic barcode gap discovery for primary species delimitation [J].Molecular Ecology，2011，21（8）：18641877.

[19]HEBERT P D N， STOECKLE M Y， ZEMLAK T S， et al.Identification of birds through DNA barcodes [J]. PLoS Biology， 2004， 2： 16571663.

[20]BURNS J M， JANZEN D H， HAJIBABAEI M， et al.DNA barcodes of closely related （but morphologically and ecologically distinct） species of skipper butterflies （Hesperiidae） can differ by only one to three nucleotides [J]. Journal of the Lepidopterists Society， 2007， 61（3）： 138153.

[21]BUCKLIN A， HOPCROFT R R， KOSOBOKOVA K N， et al. DNA barcoding of Arctic Ocean holozooplankton for species identification and recognition [J]. Deep Sea Research Part Ⅱ： Topical Studies in Oceanography， 2010， 57（1/2）： 4048.

[22]NAROMACIEL E， REID B， FITZSIMMONS N N， et al. DNA barcodes for globally threatened marine turtles： a registry approach to documenting biodiversity [J]. Molecular Ecology Resources， 2009， 10（2）： 252263.

[23]傅美蘭，彭建軍，王瑩，等.DNA條形碼技術的應用與分析[J].河南師范大學學報（自然科學版），2010，38（4）： 118122.

[24]LIPSCOMB D， PLATNICK N， WHEELER Q， et al. The intellectual content of taxonomy： a comment on DNA taxonomy[J]. Trends in Ecology and Evolution， 2003， 18（2）： 6566.

[25]TAUTZ D， ARCTANDER P， MINELLI A， et al. A plea for DNA taxonomy [J].Trends in Ecology & Evolution，2003，18（2）： 7074.

[26]李曉葉，錢路，陳茂華.DNA條形碼技術在幾種蘋果園鱗翅目害蟲鑒定中的應用[J].西北農業學報，2015，24（5）：141147.

（責任編輯：田喆）