茉莉酸甲酯調控防御酶活性誘導獼猴桃果實抗采后軟腐病

盤柳依 趙顯陽 陳明 付永琦

摘要以‘金魁獼猴桃果實為試驗材料，研究茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）調控防御酶活性抗獼猴桃采后軟腐病的效應。測定了MeJA對獼猴桃軟腐病病斑直徑、軟腐病菌Botryosphaeria dothidea抑菌作用及超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）和多酚氧化酶（PPO）等防御酶活性的影響。結果表明：在0.001～10 mmol/L濃度范圍內，MeJA對獼猴桃軟腐病菌B.dothidea的抑制作用隨濃度升高而增強;MeJA對獼猴桃果實最佳誘導濃度和熏蒸時間分別為0.1 mmol/L 和24 h，其誘導效果分別為26.01%和26.85%;獼猴桃果實經0.1 mmol/L MeJA熏蒸處理24 h后，SOD、POD、CAT、APX和PPO活性提高，其中SOD和POD活性分別較對照增加33.85%和61.61%，差異達顯著水平（P<0.05）。以上結果暗示MeJA誘導獼猴桃果實抗采后軟腐病可能與其提高防御酶活性有關。

關鍵詞茉莉酸甲酯;獼猴桃;軟腐病;誘導抗病;防御酶

中圖分類號：S 436.634

文獻標識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2018172

獼猴桃果實皮薄汁多、質地柔軟，在采收和貯運期間極易腐爛，其中軟腐病是導致我國四川、陜西和江西等獼猴桃果實貯藏腐爛的關鍵原因之一[1]。獼猴桃軟腐病主要致病菌有葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea和擬莖點霉Phomopsis sp.等，病菌通過果皮或從果面傷口侵入果實，果實發病率高達50%左右，品質嚴重下降，造成巨大的經濟損失[2]?？刂偏J猴桃果實腐爛的發生是減少其采后流通過程商品價值損失的核心問題[23]。目前獼猴桃果實采后腐爛的控制主要采用化學殺菌劑，但其給食品安全和環境保護帶來潛在隱患[4]。利用物理、化學或生物的方法誘導提高果實自身抗病性從而減輕腐爛的發生已成為采后病害控制的研究熱點[56]。

茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）是從素馨花Jasminum grandiflorum香精油中分離獲得的一種植物內源生長調節物質，在植物生長發育和應激反應研究中發揮重要作用[7]。外源MeJA作為重要逆境脅迫信號物質可誘導植物產生系列免疫響應，激發植物抗逆蛋白和防御基因表達。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）等防御酶是采后果實重要的活性自由基清除酶;PPO通過催化木質素及醌類物質形成，產生抵御病菌侵入的保護屏障。研究表明，MeJA通過調控SOD、CAT、POD、APX和PPO等防御酶活性，誘導梨[8]、芒果[9]、藍莓[10]和李[11]等防御蛋白和木質素等抗病物質的合成并活化抗氧化代謝途徑，增強果實的抗逆性，從而有效抵御病原菌的侵入，降低果實采后腐爛。在果蔬貯藏過程中，采后果實貯藏品質和抗病能力的評價與防御酶活性密切相關[12]，其相關酶活性高低是果實貯藏質量和品質衰老的重要參考指標[13]。

前人大量研究表明，MeJA在果實采后病害控制研究中發揮積極作用，但少有誘導獼猴桃抗采后軟腐病的報道。本課題組在前期預備試驗中發現MeJA熏蒸處理可有效誘導獼猴桃果實抗采后軟腐病，因此本研究以‘金魁獼猴桃果實為試驗材料，篩選MeJA的合適處理濃度和時間，并分析MeJA誘導獼猴桃抗軟腐病的效應與防御酶活性的關系，為獼猴桃果實采后軟腐病的防治提供理論依據和技術參考。

1材料與方法

1.1供試材料

供試材料為‘金魁獼猴桃Actinidia deliciosa ‘Jinkui果實，采自江西省奉新縣農業局獼猴桃試驗基地。當果實可溶性固形物含量達到6.5%～7.0%時采收，當日運抵實驗室，選擇大小均勻、無病蟲害、無機械損傷的果實，發汗24 h后待用。

葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea由江西省果蔬采后處理關鍵技術與質量安全協同創新中心提供。使用前接種于PDA培養基上于 28℃活化3～5 d，待用。

MeJA購自美國 Sigma 公司，純度98%，以少量0.1%吐溫80溶解，再用蒸餾水配成 10 mmol/L的溶液，備用。

1.2MeJA對B.dothidea的抑菌作用

采用生長速率法。配制MeJA濃度為0、0.001、0.01、0.1、1和10 mmol/L的PDA培養基，在B.dothidea培養平板邊緣用直徑7 mm打孔器取菌餅，將其分別放置于含不同MeJA濃度的培養基中央，使帶菌面與培養基充分接觸，28℃恒溫培養箱培養，逐日觀察記錄，待對照組病菌快長滿培養皿時用游標卡尺測量病斑直徑（約5～7 d）。以蒸餾水PDA培養基為空白對照，同時做以含0.1%吐溫80的蒸餾水PDA培養基對照，每個濃度重復3次，按以下公式計算抑制率：

抑菌率=[（空白對照病斑直徑-處理病斑直徑）/空白對照病斑直徑]×100%。

1.3獼猴桃果實接種B.dothidea

獼猴桃果實表面經75%乙醇消毒后用無菌挑針刺破赤道部表皮，將直徑7 mm的菌絲塊置傷口處，表面覆蓋棉球（無菌水濕潤）保濕，相對濕度保持在90%～95%，25～28℃恒溫培養5 d，測定果實病斑直徑。

1.4MeJA誘導獼猴桃果實抗軟腐病的效應

1.4.1MeJA誘導獼猴桃果實抗軟腐病的濃度篩選

稱取適量MeJA于滅菌濾紙片置密閉熏蒸室，使其濃度分別為0、0.001、0.01、0.1和1 mmol/L，20℃下熏蒸處理獼猴桃果實。對照為無菌蒸餾水，每處理15個果實，3次重復。24 h后置超凈工作臺上通風2 h后接種。各處理接種方法同1.3。根據下列公式計算MeJA對獼猴桃果實軟腐病的誘導效果。

誘導效果=（對照組病斑直徑-處理組病斑直徑）/對照組病斑直徑×100%。

1.4.2MeJA誘導獼猴桃果實抗軟腐病的持續時間

獼猴桃果實用0.1 mmol/L MeJA于接種前0、12、24、48、72 h熏蒸處理。其他方法同1.3。測定MeJA誘導獼猴桃果實軟腐病的抗性持久期。

1.4.3MeJA熏蒸處理與接種順序對獼猴桃果實抗軟腐病的影響

試驗分以下4組處理。A組： 獼猴桃果實接種軟腐病菌，作為試驗對照（CK）;B組：獼猴桃果實先接種軟腐病菌，24 h后再用0.1 mmol/L的MeJA熏蒸;C組：獼猴桃果實用0.1 mmol/L的MeJA熏蒸同時接種軟腐病菌;D組： 獼猴桃果實先用0.1 mmol/L的MeJA熏蒸，24 h后再接種軟腐病菌;其余方法同1.3。

1.5防御酶活性測定

參考1.4.1方法，用濃度為0.001、0.01、0.1和1 mmol/L MeJA熏蒸處理獼猴桃果實，24 h后接種B.dothidea，25～28℃恒溫培養5 d后取病斑周圍10～15 mm的果肉。以含0.1% 吐溫80為對照，每處理3次重復，每重復取樣15個果實（混合取樣法），用液氮將所取樣品研磨成粉末，分裝成1.0～2.0 g/管后，立即置-80℃保存備用。

SOD活性采用NBT還原法;POD活性采用愈創木酚法;APX活性、PPO活性和CAT活性采用紫外比色法，上述測定指標以每克果實樣品（鮮重）每分鐘吸光度變化值為酶活性單位（U），具體參考曹建康等[14]的方法。

1.6數據處理與統計分析

采用 Excel 2013和DPS軟件對數據進行處理和分析，用單因素方差分析統計各處理平均值的差異，Duncan 氏新復極差法比較各處理間的差異顯著性。

2結果與分析

2.1MeJA對B.dothidea的抑制作用

由表1可知，濃度為 0.001～10.0 mmol/L MeJA對B.dothidea均有一定的抑制作用，抑菌效果隨濃度的增大而增強。與空白對照相比，0.1%吐溫80抑菌率僅為0.23%， 0.001 mmol/L MeJA抑菌率為7.16%，當MeJA濃度增大至10.0 mmol/L時，對B.dothidea的抑菌率達100%。

2.2MeJA對獼猴桃果實抗采后軟腐病的誘導效應

MeJA不同處理誘導獼猴桃果實抗采后軟腐病的效果見表2。0.001～1.0 mmol/L MeJA熏蒸后，與對照相比，MeJA處理濃度為0.01～1 mmol/L時，其誘導效果先上升后下降。0.001 mmol/L MeJA處理組誘導效果為3.77%，當MeJA濃度為0.1 mmol/L時，誘導效果達最高值26.01%，隨后誘導效果逐漸降低。

0.1 mmol/L MeJA于接種前12～72 h處理獼猴桃果實，接種前12 h熏蒸處理病斑直徑與對照差異不顯著（P<0.05），誘導效果僅為3.70%;接種前24、48、72 h熏蒸組病斑直徑顯著低于對照，其中以接種前24 h誘導處理最好，其效果達26.85%，與其他處理組差異達顯著水平（P<0.05）。

如表2所示，MeJA熏蒸處理與接種順序對獼猴桃果實抗軟腐病影響顯著（P<0.05）。MeJA誘導處理后再接種軟腐病菌（D組），病斑直徑明顯小于對照（A）和其他兩組，誘導效果達22.00%，而誘導處理與接種病菌（C）同時進行以及先接種病菌后誘導處理（B）的誘導效果僅為8.41%和1.08%。

2.3不同濃度MeJA處理對獼猴桃果實防御酶活性的影響

2.3.1MeJA處理對獼猴桃果實SOD活性的影響

不同濃度的MeJA熏蒸處理后接種，獼猴桃果實SOD活性如圖1。在0.001～1.0 mmol/L范圍內，除0.001 mmol/L處理外，其他3組濃度處理獼猴桃果實SOD均顯著高于對照（P<0.05），其中當MeJA濃度為0.1 mmol/L 時SOD活性達到最高，為對照組的1.34倍（P<0.05）。

2.3.2MeJA處理對獼猴桃果實POD活性的影響

獼猴桃果實經MeJA熏蒸處理后接種，其POD活性如圖1所示。0.001和0.01 mmol/L兩組低濃度MeJA處理組POD活性與對照組差異不顯著（P>0.05），而0.1 mmol/L 處理組顯著提高了POD活性，為對照組的1.62倍（P<0.05）。當MeJA濃度增大到1.0 mmol/L時，POD活性則顯著下降至對照的67.39%（P<0.05）。

2.3.3MeJA處理對獼猴桃果實CAT活性的影響

不同濃度的MeJA熏蒸處理后接種，對獼猴桃果實CAT活性影響見圖1。0.001、0.01和1 mmol/L的MeJA處理降低CAT活性，依次為對照組的96.78%、67.75%和70.97%，而0.1 mmol/L處理組CAT活性則增強至對照的1.23倍，但與對照相比，4組濃度MeJA處理對獼猴桃果實CAT活性影響并不顯著（P>0.05）。

2.3.4MeJA處理對獼猴桃果實APX活性的影響

從圖1可知，與對照相比，當MeJA濃度為0.001～0.1 mmol/L時，獼猴桃果實APX活性無明顯差異（P>0.05）。1 mmol/L的MeJA熏蒸處理后，APX活性顯著提高至最高值，為對照組的1.38倍（P<0.05）。

2.3.5MeJA處理對獼猴桃果實PPO活性的影響

獼猴桃果實經不同濃度MeJA處理后，其PPO活性變化如圖1所示。在0.001～1.0 mmol/L 范圍內，PPO活性先上升后下降，其中0.1 mmol/L處理組PPO活性最高，為對照的1.40倍，其他3組濃度的MeJA處理后，PPO活性均低于對照，在P<0.05水平下，各處理與對照均未達到顯著水平。

3討論

JAs作為植物代謝網絡重要信號分子，既可直接抑制病原菌的生長，又能夠激發果實的免疫系統，誘導植物防御反應物質的合成，提高果實抵御病原侵染的能力[8，15]。MeJA在轉導植物信號過程中，與其他外源誘導物質類似，具有明顯的濃度效應[16]。本研究表明，0.001～10.0 mmol/L MeJA對獼猴桃果實采后軟腐病菌B.dothidea均有一定抑制作用，且抑菌效果隨MeJA濃度升高而增強。當0.001～1.0 mmol/L MeJA接種前24 h熏蒸處理果實，其誘導效應由0.1 mmol/L時最高誘導效果26.01%下降至1.0 mmol/L時9.86%，而前期試驗中10 mmol/L MeJA則加重獼猴桃果實軟腐病的發生，該結論與MeJA誘導辣椒幼苗抗青枯病[17]和葡萄果實采后病害[18]一致。另有研究表明，MeJA誘導葡萄果實抗采后灰霉病[19]和芒果炭疽病[9]的適宜濃度均為10 μmol/L，而100 μmol/L MeJA處理10 min對蘋果果實青霉病的抑制效果最好[7]，但MeJA采前處理誘導梨果實抗黑斑病的最佳濃度為7 mmol/L[8]。此外，MeJA熏蒸處理時間以接種前24 h為宜，而MeJA噴霧處理辣椒幼苗抗青枯病最佳時間為接種前48 h[17];MeJA熏蒸處理與接種順序對獼猴桃果實抗軟腐病影響明顯，MeJA先熏蒸處理再接種軟腐病菌的誘導效果顯著高于先接種病菌再熏蒸處理以及熏蒸與接種同時處理的誘導效果，該結論與郭娟華等[20]應用生防菌控制柑橘青霉病結果類似。以上結果說明MeJA誘導果實抗病效應與其處理方式、果實種類、組織和器官密切相關。

大量研究表明，植物（果實）經MeJA處理后可系統誘導SOD、POD和CAT等防御蛋白的活性水平，而這些酶類物質可清除自由基，或催化抗病物質的合成，減緩采后果實細胞傷害，抵御病原菌侵入[21]。SOD專一清除生物氧化過程中產生的活性氧和自由基，保護植物細胞結構和功能不被破壞;POD既可產生致死入侵病原物的氧化酚等毒性物質又可催化木質素的生物合成，促進受侵組織的木質化作用[22];CAT參與植物抗病等脅迫反應并和其他信號因子存在交互作用[23]。在本試驗中采用0.001～1.0 mmol/L的MeJA于接種前24 h熏蒸處理獼猴桃果實后，其SOD、POD、APX、CAT和PPO活性均高于對照，各種酶活性整體呈現先上升后下降趨勢，其中SOD和POD活性分別較對照增加33.85%和61.61%。本研究結果與MeJA處理提高藍莓[10]和雙孢蘑菇[24]POD、SOD、CAT、PPO和APX等酶活性結論一致，說明上述5種防御酶與MeJA誘導獼猴桃果實抗采后病害密切相關，其中SOD和POD活性提高最顯著，說明這兩種酶在MeJA誘導獼猴桃抗軟腐病過程可能發揮更重要的作用。另一方面，MeJA誘導果實抗病效應對防御酶活性調控可能受果實、病原菌以及處理方式等多因素影響，各種酶活性變化不盡一致，如本試驗發現MeJA可提高獼猴桃果實CAT活性，但另有試驗表明MeJA處理抑制了蘋果[7]和藍莓[10]的CAT活性，而收獲的豇豆經1 μmol/L的MeJA處理，其CAT、POD和PPO活性均降低[25]。

綜上所述，0.001～10.0 mmol/L MeJA均可抑制獼猴桃果實采后軟腐病菌B.dothidea的生長，0.1 mmol/L MeJA于接種前24 h熏蒸處理可提高獼猴桃果實POD、SOD、CAT、PPO和APX等防御酶活性，從而降低軟腐病的發生。有關MeJA誘導獼猴桃果實抗采后軟腐病的分子機理有待進一步研究。

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（責任編輯：田喆）