轉聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps基因抗蟲耐除草劑玉米的田間抗性評價

李國平 劉冰 黃建榮 邱峰 封洪強

摘要為明確轉聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps基因的抗蟲耐除草劑玉米的抗蟲性和對除草劑的耐受性，本文通過田間人工接蟲，以食葉級別、存活幼蟲數、蛀孔數、隧道長度和雌穗被害級別等分別作為評價玉米心葉期和穗期的抗蟲性標準，評價了轉聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps基因，具有抗蟲耐除草劑復合性狀的玉米品種‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR及同型非轉基因‘ND6708、‘ND6515和當地‘鄭單958品種對亞洲玉米螟、黏蟲和棉鈴蟲的抗蟲效果;通過噴施除草劑后調查玉米植株的存活率，評價上述品種對除草劑的耐受性。田間試驗結果表明：‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR兩個轉基因玉米品種對亞洲玉米螟、黏蟲及棉鈴蟲的抗性水平均為高抗，且在4葉期和8葉期噴施草甘膦后其受害率均為0，而同型對照品種和當地對照品種噴施同劑量草甘膦后受害率為100%。綜上，聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps基因，具有抗蟲耐除草劑復合性狀的玉米品種‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR對亞洲玉米螟、黏蟲和棉鈴蟲具有較強的抗蟲效果，對草甘膦具有較好的耐受性。此研究可為將來建立以轉Bt基因玉米為主要手段的綜合防治技術體系提供依據。

關鍵詞亞洲玉米螟;黏蟲;棉鈴蟲;轉基因玉米;抗性

中圖分類號：S 435.13， S 513

文獻標識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2018151

世界上第一個轉蘇云金桿菌Bacillus thuringiensis（簡稱Bt）cry1Ab基因的玉米于1996年在美國開始商業化種植，有效地控制了靶標害蟲歐洲玉米螟Ostrinia nubilalis （Hübner）的為害[1]。到2016年，美國的轉基因玉米種植面積達到3 500萬hm2，占玉米總種植面積的92%，其中抗蟲玉米占3%，耐除草劑玉米占13%，具有抗蟲和耐除草劑復合性狀的玉米占76%[2]。隨著Bt玉米的大面積種植，美國的歐洲玉米螟種群得到了有效控制，其不僅在Bt作物上的發生明顯減輕，且同一種植區內其他非Bt寄主作物上種群數量也顯著降低[34]。在現有的玉米轉化體構建中，cry1Ab和cry1F通常用于單基因和多基因的表達，而vip3A， cry2Ab2及cry1A.105只用于多基因的表達[5]。由于種植表達兩個基因的轉基因作物比種植表達單基因作物更能夠有效地延緩抗性的發生[6]， 種植轉多個基因作物在美國呈流行的趨勢。到目前為止，除美國外，巴西、阿根廷、加拿大、南非、烏干達、西班牙等17個國家批準了商業化種植轉基因玉米，我國尚未商業化種植[2]。

亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis （Guenée）、黏蟲Mythimna separata （Walker） 和棉鈴蟲Helicoverpa armigera （Hübner）是我國為害玉米的3種重要的鱗翅目害蟲[78]。亞洲玉米螟是玉米常年發生的第一大類害蟲，一般年份可造成春玉米減產10%左右，夏玉米減產20%～30%，大發生年份可致減產達50%以上[9]。黏蟲是一種暴食性害蟲，可以在小麥、玉米、水稻和其他作物上發生為害，暴發為害時植株葉片被大量取食，僅剩葉脈。2012年以來，黏蟲已經對河北、河南、陜西、遼寧以及內蒙古等地區的作物，尤其是玉米造成了嚴重的危害[8，1011]。棉鈴蟲是棉花上的重要害蟲，自20世紀80年代后期以來， 棉鈴蟲已成為我國夏玉米產區及遼寧南部春玉米穗期的主要害蟲， 該蟲主要取食玉米花絲、穗尖及籽粒，一般可造成減產5%～7%， 嚴重者減產10%以上，且常誘發玉米穗腐病的發生，影響品質[12]。

Bt玉米對靶標害蟲歐洲玉米螟有很好的控制效果， 但對其他鱗翅目害蟲的控制效果因所轉基因的不同而異。比如，西班牙種植的轉cry1Ab基因玉米對地中海蛀莖夜蛾Sesamia nonagrioides（Lefebvre）的控制效果在99%以上[13]，而當地的一種黏蟲Mythimna unipuncta在該Bt玉米上的存活率卻高達80%以上[1415]。在我國，轉cry1Ab基因玉米對亞洲玉米螟、黏蟲和棉鈴蟲都具有較好的田間抗蟲效果[9，1619]。目前有關轉聚合cry1A.105和cry2Ab2基因玉米對亞洲玉米螟、黏蟲和棉鈴蟲田間抗蟲效果還未見報道，本文通過田間人工接蟲試驗研究了轉聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps玉米對這3種鱗翅目害蟲的抗蟲效果以及對草甘膦的耐受性，為將來建立以Bt玉米為主要手段的綜合防治技術體系提供依據。

1材料與方法

1.1供試玉米品種

供試的轉聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps基因抗蟲抗除草劑復合性狀玉米品種‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR及同型非轉基因玉米品種‘ND6708、‘ND6515均由孟山都公司提供，以‘鄭單958作為當地對照品種。

1.2供試蟲源

試驗用亞洲玉米螟卵塊由中國農業科學院植物保護研究所提供;黏蟲卵由河北省農林科學院植物保護研究所提供;棉鈴蟲卵為室內用人工飼料飼養的采自河南新鄉七里營的種群。

1.3試驗小區設計

試驗于2009年7月-10月在河南省新鄉市七里營進行，試驗地周圍有500 m以上非玉米作物隔離帶?？瓜x性鑒定采用完全隨機區組設計、3次重復，每個小區面積為30 m2（5 m×6 m），行距60 cm，株距25 cm，8行區。不同小區間設有2 m寬的隔離帶，以避免害蟲在不同小區間擴散。除必要的農事操作外，生長期不施用任何殺蟲劑。

除草劑試驗采用裂區試驗設計，主區為兩個處理，即噴除草劑與不噴除草劑，副區為隨機區組設計，5個品種，重復3次，小區面積為12 m2（5 m×2.4 m），小區行長5 m，行距0.60 m，4行區。不同小區間設有2 m寬的隔離帶。施用的除草劑為孟山都公司生產的41%草甘膦異丙胺鹽（glyphosate isopropylamine salt）水劑，采用馬來西亞進口恒壓穩流噴霧器進行噴施。

1.4對亞洲玉米螟抗蟲性鑒定

分別在玉米心葉期（玉米植株6葉至8葉）和吐絲期接種亞洲玉米螟卵塊進行抗蟲鑒定。在玉米心葉期，將亞洲玉米螟黑頭卵接入玉米心葉叢中，在吐絲期將黑頭卵接入雌穗新鮮花絲上。每株接2塊卵（約60粒），并掛牌標記以便于調查記載。每小區接蟲30株。心葉期第1 次接蟲5～7 d 后，補接1 次。心葉期接蟲后，分別于第14天和21天逐株調查玉米心葉食葉級別，采用9級標準[20]。吐絲期接蟲后，在收獲前逐株調查幼蟲存活數、蛀孔數及隧道長度。

1.5對黏蟲抗蟲性鑒定

在玉米心葉期將初孵黏蟲幼蟲接入玉米心葉叢中，每小區接蟲30株，每株接種初孵幼蟲30頭。接蟲3 d后，進行第2次補接，數量同第1次。在接蟲14 d后，采用農業部953號公告10.1-2007的9級標準[21]， 調查玉米葉片食葉級別和幼蟲存活數。

1.6對棉鈴蟲抗蟲性鑒定

在玉米吐絲期將棉鈴蟲初孵幼蟲接到玉米花絲上，每小區人工接蟲30株，每株接種初孵幼蟲20～30頭，接蟲3 d 后，第2次補接，接蟲數量同第1次。人工接蟲后第14天和第21天，采用農業部953號公告10.1-2007的標準[21]，逐株調查雌穗受害級別、每個雌穗存活幼蟲數和雌穗被害長度 （cm）。

1.7耐除草劑鑒定

分別在玉米4葉期和8葉期噴施41%草甘膦異丙胺鹽水劑各1次，施用濃度為1.68 kg/hm2，用藥后1周、2周和4周調查和記錄藥害癥狀（選取藥害癥狀最輕的5株），藥害癥狀分級按5級標準執行[22]，計算受害率。

1.8數據統計與處理

用單因素方差分析不同品種間的差異，百分數進行反正弦轉換，多重比較采用Duncans新復極差法，采用統計軟件SPSS 20.0 進行，顯著性檢驗水平均為P<0.05。

2結果與分析

2.1轉基因玉米對亞洲玉米螟的田間抗性

在玉米心葉期接種亞洲玉米螟卵塊，14 d后，‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR 兩個轉基因品種食葉級別分別為1.23級和1.21級，達到高抗水平，而其同型非轉基因對照品種‘ND6708和‘ND6515食葉級別分別為4.88級和4.84級，當地對照品種‘鄭單958食葉級別為5.38級（表1）。品種間食葉級別差異顯著（F4，14=12.768，P<0.000 1），‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR兩個品種受害級別均小于其同型非轉基因對照品種‘ND6708和‘ND6515及當地對照品種‘鄭單958，且3個對照品種間差異不顯著（表1）。

在玉米心葉期接種亞洲玉米螟卵塊21 d后，‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR兩個品種食葉級別為2.72級和2.47級，達到高抗水平，而其同型對照品種‘ND6708和‘ND6515的食葉級別則分別為6.44級和6.54級，‘鄭單958為6.93級（表1）。品種間受害級別差異顯著（F4，14 =244.852， P=0.000 1），‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR兩個品種無顯著差異，均輕于其同型對照品種‘ND6708和‘ND6515以及‘鄭單958（表1）。

玉米收獲前剖稈調查顯示：‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR兩個品種平均單株蛀孔數為0個，平均活蟲數為0頭，平均隧道長度為0 cm;與其相對應的非轉基因對照品種‘ND6708、‘ND6515以及‘鄭單958的平均單株蛀孔數分別為1.11、0.91和1.24個，平均單株活蟲數分別為0.67、0.56和0.73頭，平均單株隧道長度為2.68、3.08和3.55 cm（表2）。蛀孔數、活蟲數、隧道長度在品種間差異顯著（F4，14=242.266，P=0.000 1;F4，14=262.362，P=0.000 8;F4，14=218.245，P=0.000 1），轉基因品種顯著低于非轉基因品種（表2）。表明‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR在玉米的營養生長和生殖生長階段對亞洲玉米螟的抗性均顯著高于其同型非轉基因對照和當地對照品種。

2.2轉基因玉米對黏蟲的田間抗性

在玉米心葉期接入初孵黏蟲，14 d后，‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR的葉片食葉級別分別為1.40級和1.29級，達到高抗水平;而其同型非轉基因對照品種‘ND6708和‘ND6515的葉片食葉級別分別為5.87級和5.78級，‘鄭單958食葉級別為7.14級（表3）。轉基因玉米食葉級別顯著低于其同型非轉基因對照和‘鄭單958品種（F4，14=32.294 0，P=0.000 1） （表3）。

‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR植株上的平均單株活蟲數均為0頭;而其同型非轉基因對照品種‘ND6708和‘ND6515的平均單株活蟲數分別為1.11頭和1.16頭，當地對照品種‘鄭單958的平均單株活蟲數為1.11頭（表3）。轉基因玉米上的平均存活數目顯著低于其同型非轉基因對照和當地對照品種（F4，14 =142.576， P =0.000 1）。

由以上分析可以得知，轉基因抗蟲抗除草劑復合性狀玉米‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR對黏蟲的抗性顯著高于其同型非轉基因對照和‘鄭單958品種。

2.3轉基因玉米對棉鈴蟲的田間抗性

在玉米吐絲期接入棉鈴蟲初孵幼蟲，14 d后，‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR的雌穗受害級別分別為0.11級和0.04級，幼蟲存活數均為0頭，雌穗被害長度均為0 cm。而其同型非轉基因對照品種‘ND6708和‘ND6515雌穗受害級別分別為0.61級和0.58級，幼蟲存活數分別為0.17頭和0.19頭，雌穗被害長度分別為0.22 cm和0.24 cm;當地對照品種‘鄭單958雌穗受害級別為0.64級，幼蟲存活數為0.30頭，雌穗被害長度為0.31 cm，轉基因品種顯著低于非轉基因品種（雌穗受害級別：F4，14=110.569，P=0.000 1;存活幼蟲數：F4，14=16.858，P=0.000 1;雌穗被害長度：F4，14=34.034，P=0.000 1）（表4）。

21 d后，‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR的雌穗受害級別分別為0.11級和0.08級，幼蟲存活數均為0頭，雌穗被害長度均為0 cm。而其同型非轉基因對照品種‘ND6708和‘ND6515雌穗受害級別分別為0.64級和0.67級，幼蟲存活數分別為0.22頭和0.16頭，雌穗被害長度分別為0.29 cm和0.25 cm;當地對照品種‘鄭單958雌穗受害級別為0.62級，幼蟲存活數為0.13頭，雌穗被害長度為0.28 cm。轉基因品種顯著低于非轉基因品種（雌穗被害率：F4，14=34.136，P=0.000 1;存活幼蟲數：F4，14=14.144，P=0.000 1;雌穗被害長度：F4，14=20.420，P=0.000 1）（表4）。

2.4轉基因玉米對草甘膦的耐受性

在4葉期噴施草甘膦1周后，非轉基因對照品種顯示出了明顯的受害情況。其主要癥狀為玉米植株停止生長，葉片發黃枯萎，植株死亡。而抗蟲耐除草劑復合性狀玉米品種‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR則無此現象發生。2周后，非轉基因對照品種受害率達到100%，植株全部死亡;而抗蟲耐除草劑復合性狀玉米品種‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR的植株受害率為0（表5）。

在8葉期噴施草甘膦2周和4周后，抗蟲耐除草劑復合性狀玉米品種‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR的植株受害率均為0，非轉基因對照品種受害率均達到100%。

3結論與討論

轉Bt基因玉米通過在生長季內持續表達殺蟲蛋白，害蟲的初孵幼蟲通過取食其組織而被殺死在低齡狀態，從而達到田間控制作用[23]。因此，評價轉Bt基因玉米的田間抗蟲效果通常是采用其初孵幼蟲進行抗性鑒定。本文通過人工接蟲，對聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps基因抗蟲耐除草劑玉米的抗蟲性和對除草劑的耐受性進行了田間抗性評價，結果表明‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR兩個轉基因品種對河南新鄉玉米常發鉆蛀性害蟲玉米螟具有很好的抗蟲效果，對穗期棉鈴蟲的抗性也較高，對偶發性害蟲黏蟲也表現出了極高的抗性，同時‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR對草甘膦也表現出了很好的耐受性。表現出與轉cry1A.105+cry2Ab2基因的MON89034相似的抗蟲效果[24]。

玉米在整個生長季常常遭受多種害蟲的為害，因此評價轉Bt基因玉米對多種害蟲的田間抗性效果， 能夠更全面地了解玉米轉化體的抗性譜，對于其適生區的種植具有很好的田間指導作用。在我國，亞洲玉米螟是玉米上的第一大害蟲，在全國玉米產區廣泛分布，而棉鈴蟲在黃淮海棉區、長江棉區等常年為害玉米[12]。黏蟲是一種典型的遷飛性偶發害蟲，在特殊年份會大發生[11]。因此，應根據當地種植作物類型及其害蟲種類，在同一地區合理使用抗蟲作物。種植表達Cry1A.105和Cry2Ab2蛋白的轉基因玉米與我國目前已經商業化種植的轉Bt基因棉花不同，Bt棉大多表達單一的Cry1Ac蛋白，而Cry1A.105和Cry2Ab2蛋白與其殺蟲機制不同，由于作用位點的增多，害蟲同時對兩種殺蟲基因產生抗性的幾率比單個基因低，可以延緩抗性的發展。因此，即使在黃淮海地區種植此類型的轉基因品種，其引起棉鈴蟲對Bt棉產生交互抗性的風險也相對較小。

本文僅評價了轉聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps基因玉米對亞洲玉米螟、棉鈴蟲和黏蟲的抗性。但隨著農業產業結構的調整、玉米耕作模式的改變以及氣候變化等多種因素的影響，為害玉米的害蟲種類也在不斷發生變化。目前，桃蛀螟Conogethes punctiferalis （Guenée）在玉米上為害逐年加重[25]，尤其在黃淮海夏玉米區，嚴重時在玉米果穗上的種群數量和為害程度甚至超過亞洲玉米螟，成為玉米穗期的主要害蟲[26]。在今后進行轉基因抗蟲玉米的田間抗性鑒定時，需要進一步研究其對桃蛀螟的抗性。

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（責任編輯：楊明麗）