pH對褐環粘蓋牛肝菌蛋白質和核酸的影響

蔣瑩 程永樂 曹代京 陳有君 李國光 閆偉

摘要為了探明環境pH對褐環粘蓋牛肝菌（Suillus luteus（L.：Fr.）Gray）生長代謝的影響機理，研究不同pH條件下液體培養褐環粘蓋牛肝菌菌絲中蛋白質和核酸的含量變化，結果顯示：該菌在pH 3.0～6.0范圍內，隨著pH的增加，蛋白質及核酸的含量逐漸增加，并在pH 6.0時達到最高值;在pH 6.0～8.0范圍內，蛋白質及核酸的含量迅速降低。蛋白質的含量和RNA、DNA的含量之間極顯著相關，相關系數分別達0.923和0.977，DNA和RNA的含量之間也極顯著相關，相關系數達0.927。該研究可為進一步探索褐環粘蓋牛肝菌適應與調節環境pH機理方面提供依據。

關鍵詞褐環粘蓋牛肝菌;pH;蛋白質;核酸

中圖分類號S646.3文獻標識碼A文章編號0517-6611（2019）02-0004-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.002

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

褐環粘蓋牛肝菌（Suillus luteus（L.：Fr.）Gray）是分布于我國甘肅、內蒙古[1]、陜西、黑龍江、西藏、遼寧以及廣東等地的外生菌根真菌，不同地區土壤的酸堿度不同導致菌絲體的生長狀況不盡相同[2-3]，所以環境pH對該菌的影響引發大量學者的研究討論。張茹琴等[4]發現該菌的最適生長pH為5.3～6.7，且培養后培養基的pH降低。雷增普等[5]通過大田試驗發現，該菌具有抗堿能力（土壤pH 8.6）。姚慶智等[6]發現該菌在pH 6～7時生長最為旺盛。宋微等[7]研究發現，該菌在pH 4.0～8.0的固體培養基上能生長，且最適pH為5.0，在pH小于5.0或者大于6.0時，該菌的增長速度減緩，菌苔變薄。劉淑清等[8]通過試驗發現，含有檸檬酸-磷酸二氫鉀緩沖液且pH為4.5的培養基中該菌的生物量最高，當pH大于4.5時，菌絲的生物量隨著pH的增高而逐漸降低[8]。劉強等[9]研究發現，在NaCl濃度為0.1 mol/L且pH為6.0時，該菌長勢最好，隨著環境pH的增加，菌體受到的抑制作用也愈加明顯。劉楊[10]研究不同培養基、pH、碳氮源等因素對該菌的影響，發現該菌在Pach培養基上的最適生長pH為4.5。王明慧[11]發現該菌的蛋白含量隨著pH的升高而升高，在pH為5.0時增長速率最大，且在pH 7.0時蛋白含量達到最大值，達到峰值后蛋白質含量迅速下降。劉萌[12]發現該菌在pH 5.0～6.0時分泌的有機酸最多，生長狀況最好。但是，環境pH對該菌核酸含量的影響還缺少研究。

通過對多種絲狀真菌的研究發現，生物響應外界環境酸堿性的改變是通過自身基因表達的改變來實現的[13]。嗜水氣單胞菌在中性或偏酸性（pH 7.0和pH 5.0）環境中，4種毒性基因可以表達，而在堿性環境中僅僅只有1種基因可以表達[14]。賈海鋒等[15]通過不同pH處理草莓果實葉片的試驗，發現隨著pH的增加基因表達量呈顯著上升趨勢，并在pH 6時獲得最大值。沈靜等[16]發現低pH嚴重影響水稻根系細胞中細胞膜質子泵基因的表達，在pH 5.5時該基因的表達量最高。有研究表明，細胞膜質子泵的最高活性范圍為pH 6.0～6.5[17-18]，pH通過影響其活性進而影響其表達量。以上說明環境pH會對生物體的基因產生影響。雖然部分研究學者針對pH與褐環粘蓋牛肝菌之間的關系做了大量研究，但從蛋白質及核酸含量方面研究該菌與環境pH之間關系的報道目前還不是很多。筆者研究了該菌在不同pH培養下蛋白質和核酸的含量變化，以期為深入了解褐環粘蓋牛肝菌生理學及其改變環境pH的調控機制提供依據。

1材料與方法

1.1試驗處理

將在Pach培養基中培養7 d的褐環粘蓋牛肝菌Sp9菌株（由內蒙古農業大學菌根技術研究室提供）轉接到不同pH（滅菌后pH為3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0和8.0）的液體培養基中，每瓶接入11塊，150 mL三角瓶裝液量為50 mL，置于25 ℃恒溫培養箱中靜置培養，并每天更換其培養基，5 d后濾出菌絲，備用。

1.2試驗方法

1.2.1蛋白質的測定。

取0.01 g菌絲用液氮冷卻后于冰浴中進行研磨，加入1 mL研磨緩沖液后裝入離心管中于-4 ℃、6 000 r/min條件下離心5 min。取上清液，再次置于離心管中，并于-4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，獲得上清液。用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量（以牛血清蛋白溶液為標準液，用考馬斯亮藍法做標準曲線：y=85.816x-1.098 6，其中x為吸光度，y為蛋白質含量，線性相關系數r為0.999，根據標準曲線計算出8個樣品中相應蛋白質的含量）。

1.2.2RNA含量的測定。取0.01 g菌絲用液氮冷卻后在冰浴中充分研磨至粉末，按照RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根公司）所提供的方法提取該菌的總RNA，并溶于ddH2O中，取1 μL RNA ddH2O溶液于Biodrop中檢測RNA含量。

1.2.3DNA含量的測定。取0.01 g菌絲用液氮冷卻后于冰浴中充分研磨至粉末，按照植物基因組DNA提取試劑盒（天根公司）所給的方法提取該菌的總DNA，并溶于ddH2O。取1 μL DNA ddH2O溶液于Biodrop中進行DNA含量檢測。

2結果與分析

2.1pH對褐環粘蓋牛肝菌蛋白質含量的影響

不同環境pH培養5 d后菌絲體的蛋白含量如圖1所示。由圖1可知，當pH小于6時，蛋白質含量隨著pH的升高而逐漸上升，在pH為3.0～4.5時，蛋白質的含量上升緩慢，每增加1個單位的pH，蛋白質平均增加215.79 ng;在pH 4.5～5.0范圍內，單位pH的蛋白質增長量極其微小，僅增加43.07 ng;在pH為5.0～6.0時，蛋白質含量迅速增長，單位pH的蛋白質增長量高達714.35 ng，且在pH 6.0時蛋白質的含量達到最高值;達到峰值后，隨著pH的增加，蛋白質含量逐漸降低，在pH為6.0～8.0時，蛋白質含量顯著下降，單位pH的蛋白質減少量達到330.59 ng。就整體趨勢而言，蛋白質含量受環境pH的影響較大，在pH 6.0的條件下，蛋白質含量最高，推測pH 6.0為該菌的最適生長pH。

2.2pH對褐環粘蓋牛肝菌RNA含量的影響

不同環境pH培養5 d后菌絲體的RNA含量如圖2所示。由圖2可知，當pH小于6時，RNA含量隨著pH的升高而升高，在pH為3.0～4.5時，RNA含量增長緩慢，環境pH每增加1個單位，RNA含量增加77.30 ng;在pH為4.5～6.0時，RNA含量顯著增加，平均環境pH每增加1個單位，RNA含量的增長量可達283.79 ng，并在pH 6.0時達到峰值，為639.60 ng/mg。此后，隨著pH的增加，RNA含量開始下降，在pH為6.0～7.0時，RNA含量逐漸減少，單位減少量為150.38 ng;在pH為7.0～8.0時，RNA含量迅速下降，單位pH的RNA減少量達到313.16 ng，說明在堿性環境下不利于RNA的合成。就整體趨勢而言，環境pH對RNA含量影響較大，RNA含量在pH 6.0時獲得最大值，因此推測該菌的最適生長pH為6.0。

2.3pH對褐環粘蓋牛肝菌DNA含量的影響

不同環境pH培養5 d后菌絲體的DNA含量如圖3所示。由圖3可知，當pH小于6.0時，DNA含量隨著pH的升高而逐漸上升，在pH為3.0～4.0時，DNA含量增長緩慢，單位pH的DNA增加量為62.44 ng;在pH 4.0～4.5時DNA含量幾乎不變;在pH 4.5～6.0時，DNA含量顯著增加，單位pH的DNA增加量可達90.23 ng，并在pH 6.0時DNA含量達到最大值;在pH 6.0～8.0時，DNA含量快速下降，單位pH的DNA減少量可達59.21 ng。就整體變化趨勢而言，DNA含量受環境pH影響較大，DNA含量在pH 6.0時最高，因此推測該菌的最適生長pH為6.0。

3結論與討論

3.1褐環粘蓋牛肝菌蛋白質含量與RNA含量的相關性

由圖4可以看出，蛋白質含量隨RNA含量的增加而增加，相關分析表明二者之間具有極顯著的相關關系（相關系數r=0.923，P<0.01）。菌絲中蛋白質含量與RNA含量的線性回歸方程為y=1.5722x+1 832.1。

通過對圖1和圖2進行對比發現，在pH 3.0～6.0的培養條件下，蛋白質與RNA的含量都隨著pH的升高而逐漸上升，其中在pH 3.0～4.5時，RNA含量的增加速率明顯高于蛋白質含量的增長速率，單位菌絲體中平均1 ng RNA可以翻譯為14.859 ng蛋白質;在pH 4.5～6.0時，蛋白質含量增長率高于RNA含量增長率，單位菌絲體中平均1 ng RNA可以翻譯為6.441 ng蛋白質，雖然翻譯率下降，但由于轉錄率較高，獲得的RNA含量較高，所以依然獲得較高的蛋白質含量，并在pH 6.0的培養條件下蛋白質含量達到峰值，說明在該pH范圍內更利于蛋白質的合成;在pH 6.0～8.0的培養條件下，二者的含量都明顯下降，單位菌絲體中平均1 ng RNA可以翻譯為7.732 ng蛋白質，雖然翻譯率有所提高，但由于該范圍的環境pH培養條件下RNA的合成量逐漸降低，因此翻譯獲得的蛋白質含量依然呈下降趨勢，尤其在pH 7.0～8.0時，RNA含量的下降速率比蛋白質的下降速率更大。

3.2褐環粘蓋牛肝菌蛋白質含量與DNA含量的相關性

由圖5可以看出，蛋白質含量隨DNA含量的增加而增加，相關分析表明二者之間具有極顯著的相關關系（相關系數r=0.977，P<0.01）。菌絲中蛋白質含量和DNA含量的線性回歸方程為y=5.452 4x+1 466.9。

通過對圖1和圖3進行對比發現，在pH 3.0～6.0的培養條件下，蛋白質和DNA的含量都隨著pH的增加而增加，其中在pH 3.0～4.5時，DNA的增長率接近蛋白質增長率的7倍，說明在該pH范圍內，更有利于DNA的合成，單位基因的表達量不大，導致蛋白質含量的增加速率緩慢，但是在pH 4.5～6.0 的培養條件下，蛋白質的增長率迅速增加，即基因的表達量顯著增加，說明在該pH范圍內更有利于基因的表達。在pH 6.0～8.0的培養條件下，二者含量均顯著下降，其中，在pH 6.0～7.0時，DNA含量的減少率明顯高于蛋白質含量的減少率，說明在該環境pH下更不利于DNA的生成;在pH 7.0～8.0時，二者含量均繼續下降接近于最低值，說明在堿性條件下不利于該菌基因的表達。

3.3褐環粘蓋牛肝菌RNA含量與DNA含量的相關性

由圖6可知，RNA含量隨DNA含量的增加而增加，相關分析表明二者之間具有極顯著的相關關系（相關系數r=0.927，P<0.01）。菌絲中RNA含量與DNA含量線性回歸方程為y=3.037 1x-161.93。

通過對圖2和圖3進行綜合分析，可以發現，在pH 3.0～4.5的培養條件下，單位菌絲體中平均1 ng DNA可以轉錄為1.443 ng RNA;在pH 4.5～6.0的培養條件下，單位菌絲體中平均1 ng DNA可以轉錄為2.254 ng RNA，轉錄率有所提高，并在pH 6.0的培養條件下獲得最高RNA含量;在pH 6.0～8.0的培養條件下，單位菌絲體中平均1 ng DNA可以轉錄為1.956 ng RNA，轉錄率有所下降，說明該范圍的環境pH下，不利于RNA的合成。

綜上所述，在pH 3.0～6.0的培養條件下，褐環粘蓋牛肝菌菌絲體中蛋白質和核酸的含量都隨著pH的增加而逐漸增加，并在pH 6.0時獲得峰值，此后隨著pH的增加其含量均顯著降低。該結果與孫琳[19]、蔡楠楠[20]在pH 6.0獲得最大生物量的結果相吻合，因此，可以認為弱酸性環境下更有利于褐環粘蓋牛肝菌的生長，并且該菌的最適生長pH為6.0。

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