灰色鏈霉菌LD1810產(chǎn)胰蛋白酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

王興吉 王克芬 劉文龍 郭慶亮

摘要胰蛋白酶（Trypsin）作用于堿性氨基酸精氨酸及賴氨酸羧基所組成的肽鍵，被廣泛用于食品、醫(yī)藥和皮革等工業(yè)領(lǐng)域。該文研究高產(chǎn)誘變灰色鏈霉菌LD1810產(chǎn)胰蛋白酶（SGT）的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基，探討SGT的最佳發(fā)酵條件，為SGT的商業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。通過單因素試驗和L9（34）正交試驗確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組分：葡萄糖 20 g/L，大豆粉 40 g/L，KH2PO4 2.5 g/L，CaCl2 1 g/L。最適發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度28 ℃，初始pH 8.0，300 mL 三角瓶的裝液量100 mL，搖床轉(zhuǎn)速 240 r/min。

關(guān)鍵詞灰色鏈霉菌;胰蛋白酶;培養(yǎng)基;發(fā)酵條件

中圖分類號S-3文獻標識碼A文章編號0517-6611（2019）02-0007-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.003

胰蛋白酶（Trypsin，EC 3.4.4.4）是蛋白水解酶類的一種[1]，具備由天冬氨酸、組氨酸和絲氨酸氨基酸殘基所組成的催化三聯(lián)體的典型特征。胰蛋白酶具有的2個重要特征可以將其與其他絲氨酸蛋白酶區(qū)分開來：能專一性地把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側(cè)切斷還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其他酶的前體，起活化作用[2]。另外，在堿性條件下胰蛋白酶具有較高的催化活力，所以是一種堿性蛋白酶。胰蛋白酶在醫(yī)藥[3-6]、食品[7]、皮革加工[8]、紡織和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域[9]有著廣泛的應(yīng)用價值。

通過鏈霉菌屬菌株產(chǎn)的胰蛋白酶主要有紅熱鏈球菌Streptomyces eryrhreus產(chǎn)胰蛋白酶（SET），弗氏鏈霉菌Strepromyces fradiae產(chǎn)胰蛋白酶（SFT）和灰色鏈霉菌Streptomyces? griseus產(chǎn)胰蛋白酶（SGT）。目前，微生物產(chǎn)胰蛋白酶仍處于研究階段，產(chǎn)酶效率不高，與商業(yè)化生產(chǎn)仍有差距。該研究探討高產(chǎn)胰蛋白酶的誘變灰色鏈霉菌菌株的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基，同時探尋SGT的最佳發(fā)酵條件，為SGT的商業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌株

灰色鏈霉菌為山東隆科特酶制劑有限公司省重點實驗室誘變篩選保藏菌種（Streptomyces griseus），命名為LD 1810。

1.2培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基;

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：豆餅粉40 g/L，葡萄糖20 g/L，硫酸鎂2 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L。

1.3培養(yǎng)基組成的確定

保持基礎(chǔ)培養(yǎng)基其他組成不變，依次改變培養(yǎng)基的氮源、碳源和無機鹽，測定發(fā)酵液中胰蛋白酶活力。確定最佳氮源、碳源和無機鹽后，對氮源、碳源及無機鹽進行正交設(shè)計試驗，以找出菌體發(fā)酵最好的優(yōu)化培養(yǎng)基，試驗因素及水平見表1。

1.4產(chǎn)酶培養(yǎng)條件的確定

試驗分別從培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始 pH、搖瓶培養(yǎng)基裝液量和搖床轉(zhuǎn)速等方面進行單因素試驗，確定最佳培養(yǎng)條件。

1.4.1培養(yǎng)溫度對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

分別設(shè)定發(fā)酵溫度為24、26、28 、30和 32 ℃，在豆粕40.0%、磷酸二氫鉀2.5%、氯化鈣1.0%、葡萄糖20.0%的培養(yǎng)基，pH 8.0，裝液量100 mL，240 r/min條件下發(fā)酵5 d后，取發(fā)酵液離心測定酶活力，考察不同溫度條件下發(fā)酵產(chǎn)酶的變化規(guī)律。

1.4.2初始pH對發(fā)酵產(chǎn)酶影響的研究。

分別取初始pH為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，在豆粕40.0%、磷酸二氫鉀2.5%、氯化鈣1.0%、葡萄糖20.0%的培養(yǎng)基，28 ℃，裝液量100 mL，240 r/min條件下發(fā)酵5 d后，取發(fā)酵液離心測定酶活力，考察不同pH條件下發(fā)酵產(chǎn)酶的變化規(guī)律。

1.4.3裝液量對發(fā)酵產(chǎn)酶影響的研究。

裝液量分別選取50、75、100、125、150和200 mL，在豆粕40.0%、磷酸二氫鉀2.5%、氯化鈣1.0%、葡萄糖20.0%的培養(yǎng)基，28 ℃，pH 8.0，240 r/min條件下發(fā)酵5 d后，取發(fā)酵液離心測定酶活力，考察不同裝液量條件下發(fā)酵產(chǎn)酶的變化規(guī)律。

1.4.4轉(zhuǎn)速對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

分別取轉(zhuǎn)速為100、150、200、240、260和300 r/min，在豆粕40.0%、磷酸二氫鉀2.5%、氯化鈣1.0%、葡萄糖20.0%的培養(yǎng)基，28 ℃，pH 8.0，裝液量100 mL條件下發(fā)酵5 d后，取發(fā)酵液離心測定酶活力，考察不同轉(zhuǎn)速條件下發(fā)酵產(chǎn)酶的變化規(guī)律。

1.5酶活測定方法

胰蛋白酶參照中國藥典方法[10]進行測定。

2結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵時間的確定

灰色鏈霉菌在搖瓶中培養(yǎng)7 d，每24 h 取樣測酶活。由圖1可知，灰色鏈霉菌發(fā)酵前5 d，胰蛋白酶酶活性迅速上升，酶活力持續(xù)增加，發(fā)酵5 d時酶活力最高達到81.5 U/mL。發(fā)酵5 d后，隨著發(fā)酵時間的延長，酶活有所下降，究其原因是發(fā)酵后期，營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，微生物衰老死亡，產(chǎn)酶能力下降。綜合發(fā)酵的變化情況，選取5 d作為發(fā)酵時間。

2.2灰色鏈霉菌產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基的確定

2.2.1碳源種類對灰色鏈霉菌產(chǎn)胰蛋白酶的影響。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加濃度為2%的不同碳源作為唯一碳源，發(fā)酵產(chǎn)酶結(jié)果見圖2，結(jié)果表明，葡萄糖作為碳源時灰色鏈霉菌所產(chǎn)酶活最大，為85.4 U/mL，麥芽糖次之，菌種對這2種碳源利用效果較好，說明菌體對麥芽糖和葡萄糖的利用最好。葡萄糖不僅能夠提供合成代謝所需的能量，也能在細胞分解代謝中提供小分子碳架，同時葡萄糖較為廉價，因而選擇葡萄糖作為碳源。

2.2.2氮源種類對灰色鏈霉菌產(chǎn)胰蛋白酶的影響。