灰色鏈霉菌LD1810產胰蛋白酶發酵條件的優化

王興吉 王克芬 劉文龍 郭慶亮

摘要胰蛋白酶（Trypsin）作用于堿性氨基酸精氨酸及賴氨酸羧基所組成的肽鍵，被廣泛用于食品、醫藥和皮革等工業領域。該文研究高產誘變灰色鏈霉菌LD1810產胰蛋白酶（SGT）的最優發酵培養基，探討SGT的最佳發酵條件，為SGT的商業化生產提供技術參考。通過單因素試驗和L9（34）正交試驗確定發酵培養基的最佳組分：葡萄糖 20 g/L，大豆粉 40 g/L，KH2PO4 2.5 g/L，CaCl2 1 g/L。最適發酵條件為發酵溫度28 ℃，初始pH 8.0，300 mL 三角瓶的裝液量100 mL，搖床轉速 240 r/min。

關鍵詞灰色鏈霉菌;胰蛋白酶;培養基;發酵條件

中圖分類號S-3文獻標識碼A文章編號0517-6611（2019）02-0007-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.003

胰蛋白酶（Trypsin，EC 3.4.4.4）是蛋白水解酶類的一種[1]，具備由天冬氨酸、組氨酸和絲氨酸氨基酸殘基所組成的催化三聯體的典型特征。胰蛋白酶具有的2個重要特征可以將其與其他絲氨酸蛋白酶區分開來：能專一性地把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側切斷還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其他酶的前體，起活化作用[2]。另外，在堿性條件下胰蛋白酶具有較高的催化活力，所以是一種堿性蛋白酶。胰蛋白酶在醫藥[3-6]、食品[7]、皮革加工[8]、紡織和農業領域[9]有著廣泛的應用價值。

通過鏈霉菌屬菌株產的胰蛋白酶主要有紅熱鏈球菌Streptomyces eryrhreus產胰蛋白酶（SET），弗氏鏈霉菌Strepromyces fradiae產胰蛋白酶（SFT）和灰色鏈霉菌Streptomyces? griseus產胰蛋白酶（SGT）。目前，微生物產胰蛋白酶仍處于研究階段，產酶效率不高，與商業化生產仍有差距。該研究探討高產胰蛋白酶的誘變灰色鏈霉菌菌株的最優發酵培養基，同時探尋SGT的最佳發酵條件，為SGT的商業化生產提供依據。

1材料與方法

1.1菌株

灰色鏈霉菌為山東隆科特酶制劑有限公司省重點實驗室誘變篩選保藏菌種（Streptomyces griseus），命名為LD 1810。

1.2培養基斜面培養基：PDA培養基;

基礎發酵培養基：豆餅粉40 g/L，葡萄糖20 g/L，硫酸鎂2 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L。

1.3培養基組成的確定

保持基礎培養基其他組成不變，依次改變培養基的氮源、碳源和無機鹽，測定發酵液中胰蛋白酶活力。確定最佳氮源、碳源和無機鹽后，對氮源、碳源及無機鹽進行正交設計試驗，以找出菌體發酵最好的優化培養基，試驗因素及水平見表1。

1.4產酶培養條件的確定

試驗分別從培養溫度、培養基初始 pH、搖瓶培養基裝液量和搖床轉速等方面進行單因素試驗，確定最佳培養條件。

1.4.1培養溫度對發酵產酶的影響。

分別設定發酵溫度為24、26、28 、30和 32 ℃，在豆粕40.0%、磷酸二氫鉀2.5%、氯化鈣1.0%、葡萄糖20.0%的培養基，pH 8.0，裝液量100 mL，240 r/min條件下發酵5 d后，取發酵液離心測定酶活力，考察不同溫度條件下發酵產酶的變化規律。

1.4.2初始pH對發酵產酶影響的研究。

分別取初始pH為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，在豆粕40.0%、磷酸二氫鉀2.5%、氯化鈣1.0%、葡萄糖20.0%的培養基，28 ℃，裝液量100 mL，240 r/min條件下發酵5 d后，取發酵液離心測定酶活力，考察不同pH條件下發酵產酶的變化規律。

1.4.3裝液量對發酵產酶影響的研究。

裝液量分別選取50、75、100、125、150和200 mL，在豆粕40.0%、磷酸二氫鉀2.5%、氯化鈣1.0%、葡萄糖20.0%的培養基，28 ℃，pH 8.0，240 r/min條件下發酵5 d后，取發酵液離心測定酶活力，考察不同裝液量條件下發酵產酶的變化規律。

1.4.4轉速對發酵產酶的影響。

分別取轉速為100、150、200、240、260和300 r/min，在豆粕40.0%、磷酸二氫鉀2.5%、氯化鈣1.0%、葡萄糖20.0%的培養基，28 ℃，pH 8.0，裝液量100 mL條件下發酵5 d后，取發酵液離心測定酶活力，考察不同轉速條件下發酵產酶的變化規律。

1.5酶活測定方法

胰蛋白酶參照中國藥典方法[10]進行測定。

2結果與分析

2.1發酵時間的確定

灰色鏈霉菌在搖瓶中培養7 d，每24 h 取樣測酶活。由圖1可知，灰色鏈霉菌發酵前5 d，胰蛋白酶酶活性迅速上升，酶活力持續增加，發酵5 d時酶活力最高達到81.5 U/mL。發酵5 d后，隨著發酵時間的延長，酶活有所下降，究其原因是發酵后期，營養物質消耗殆盡，微生物衰老死亡，產酶能力下降。綜合發酵的變化情況，選取5 d作為發酵時間。

2.2灰色鏈霉菌產酶發酵培養基的確定

2.2.1碳源種類對灰色鏈霉菌產胰蛋白酶的影響。

基礎培養基中分別添加濃度為2%的不同碳源作為唯一碳源，發酵產酶結果見圖2，結果表明，葡萄糖作為碳源時灰色鏈霉菌所產酶活最大，為85.4 U/mL，麥芽糖次之，菌種對這2種碳源利用效果較好，說明菌體對麥芽糖和葡萄糖的利用最好。葡萄糖不僅能夠提供合成代謝所需的能量，也能在細胞分解代謝中提供小分子碳架，同時葡萄糖較為廉價，因而選擇葡萄糖作為碳源。

2.2.2氮源種類對灰色鏈霉菌產胰蛋白酶的影響。