東北地區雞源多重耐藥大腸桿菌整合子的檢測

馮濤 何紀元 薛原

摘要[目的]了解東北地區雞源大腸桿菌耐藥性的流行特征以及整合子-基因盒系統的耐藥機制。[方法]在檢測耐藥性的基礎上，采用PCR方法對整合酶和整合子進行檢測和克隆測序，并且對檢測結果和耐藥基因盒與GenBank數據庫的序列進行比對和分析。[結果]413株分離菌中整合子檢出率為71.91%，整合酶 Ⅰ 和整合酶 Ⅱ 的檢出率分別為65.52%和54.48%，整合酶 Ⅲ未檢出。序列分析得出，共包含6種整合子，各自攜帶不同組合的基因盒。[結論]Ⅰ 型整合子在細菌耐藥性的傳播過程中發揮著至關重要的作用。

關鍵詞雞;大腸桿菌;耐藥性;PCR;整合子;基因盒

中圖分類號S852.61文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）02-0083-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.024

雞主要為人類提供食用價值和藥用價值，也有一些雞的種類具有觀賞價值[1]。隨著抗菌藥物使用頻率的逐漸增加，大腸桿菌在臨床上的耐藥情況也越來越強，在近幾年的研究中多重耐藥的情況也較多[2]。耐藥基因的傳播不僅對雞源的飼養有重要影響，而且對人類生活也會產生間接影響。

整合子是一種可以移動遺傳的物質，具有特異性結合和捕獲耐藥基因的能力，在整合酶的催化下完成表達過程[3]。整合子有2種途徑進行表達：一是可以與質粒或者染色體連接，二是成為轉座子的組成部分，繼而完成其移動和表達的過程[4]。整合子隨質粒和轉座子的表達加速了耐藥基因水平以及垂直傳播，耐藥水平和多重耐藥性均有上升。整合子是一個組合基因，包括兩端高度保守序列和存在于二者之間的可變區域。在保守序列中含有整合酶基因、決定特異性的序列片段以及可變區的啟動子，整合子可以通過編碼整合酶特異性來選擇結合特定的基因盒。筆者對東北地區不同雞源養殖場的大腸桿菌耐藥性和 Ⅰ 型整合子進行了檢測，旨在了解雞源大腸桿菌的整合子-基因盒系統的流行情況，為控制雞的多重耐藥性提供依據和研究方向。

1材料與方法

1.1菌株

大腸桿菌質控菌株（菌株編號為ATCC25922），由中國獸醫藥品監察所提供;試驗用大腸桿菌413株，分離自東北不同地區雞養殖場。

1.2主要試劑

22種藥敏紙片，包括安普霉素（APR）、氨芐西林（AMP）、環丙沙星（CIP）、頭孢噻吩（KF）、頭孢他啶（CAZ）、阿米卡星（AK）、氯霉素（C）、阿莫西林/克拉維酸（AMC）、四環素（TE）、諾氟沙星（NOR）、亞胺培南（IPM）、氟苯尼考（FFC）、氨曲南（ATM）、氧氟沙星（OFX）、復方新諾明（SXT）、慶大霉素（N）、強力霉素（DO）、多黏菌素B（PB）、卡那霉素（K）、新霉素（NEO）、恩諾沙星（ENR）、阿莫西林（AMX），均由杭州天和微生物試劑有限公司提供;質粒小量提取試劑盒、DNA 片段凝膠回收試劑盒均由愛思進生物技術有限責任公司提供;水解酪蛋白瓊脂培養基（mueller-hinton，MH），由西隴科學股份有限公司提供;10×Buffer、dNTP、Taq 酶、DL2000 Marker、6×Loading Buffer、pMD18-T 載體、感受態細胞E.coli DH5α均由TaKaRa公司提供。

1.3藥敏試驗

當質控菌株的抑菌環處于CLSI[5]的標準范圍內時，試驗菌株的抑菌結果有效且穩定。試驗采用WHO推薦的Kirby-Bauer法[5]對413株大腸桿菌進行藥敏試驗，按照抗生素的敏感性擴散的抑菌環直徑來確定不同菌株的耐藥性。然后，采用耐藥、中介、敏感3種評定標準來標定抑菌環的大小，最后進行匯總分析。

1.4整合酶基因的檢測

PCR擴增體系（25.00 μL）如下：2.50 μL 10×Buffer，2.00 μL dNTP，上、下游引物各1 μL、0.25 μL Taq酶，2.00 μL模板。按照參考文獻[6-8]設計引物序列。PCR擴增程序如下：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環;72 ℃延伸10 min。通過瓊脂糖凝膠電泳對擴增出的PCR產物進行驗證。

1.5整合子的檢測

參照文獻[9]設計引物序列。PCR擴增體系同“1.4”。PCR擴增程序如下：94 ℃預 變 性 5 min;94 ℃變性30 s，55.4 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環;72 ℃再延伸10 min。對擴增出的PCR產物使用瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。

1.6整合子-基因盒的克隆與測序

將整合子的陽性PCR產物擴增樣本用膠回收純化后與18-T載體連接，并轉入感受態細胞E.coli DH5α中克隆復制，將質粒樣本送至哈爾濱博仕生物技術有限公司測序部進行序列測定。將返回的核苷酸序列用DNASTAR軟件分析，與GenBank數據庫進行比較。

2結果與分析

2.1大腸桿菌的耐藥性

413株雞源大腸桿菌的耐藥情況表現比較復雜，結果見圖1。由圖1可知，對氨芐西林、頭孢噻吩和四環素3種抗生素的耐藥率都超過80%;對有些藥物的敏感性較強，如多黏菌素B、氨曲南和阿米卡星，雞源大腸桿菌對這些抗生素的敏感性達70%。

在413株雞源大腸桿菌中，試驗菌株中8重耐藥的比例最大，達7.02%。分離菌株的多重耐藥現象比較明顯，最少為3種，最多為21種，結果見圖2。

2.2整合酶基因的檢測

413株大腸桿菌中整合酶 Ⅰ 被檢出為陽性的有271株，檢出率為65.52%，見圖3。整合酶 Ⅱ 的陽性菌株有225株，陽性率為54.48%，見圖4。整合酶 Ⅲ基因未檢出。

2.3整合子的檢測

413株雞源大腸桿菌中，Ⅰ 型整合子基因的PCR 產物片段出現多種不同大小的條帶，見圖5。413株大腸桿菌菌株中297株 Ⅰ 型整合子基因擴增結果呈陽性，檢出率為71.91%。

3討論

該試驗中雞源大腸桿菌對采用的22種抗生素具有不同程度的耐藥性，多重耐藥可達21種，其中較高的是8重耐藥，耐8種抗生素的占總數的7.02%，3重及3重耐藥以上的耐藥菌株包括391株，所占比例可達94.68%。這些結果都表明東北地區雞源養殖場在治療普通疾病時具有較復雜的用藥過程，多重耐藥情況明顯，單一抗生素的耐藥性卻并不普遍，大腸桿菌在東北地區使用的抗生素種類復雜，在不斷的選擇壓力下逐漸進化為多重耐藥的菌株[10]。

該試驗使用的PCR引物擴增技術篩選 Ⅰ 型整合子和整合酶，以了解整合子的流行和傳播程度。檢測結果顯示，雞源大腸桿菌 Ⅰ 型整合子存在具有廣泛性和普遍性，413株大腸桿菌菌株中檢出 Ⅰ 型整合子297株，檢出率達到71.91%。通過GenBank核酸序列數據庫對比分析，發現雞源大腸桿菌Ⅰ 型整合子攜帶的基因盒組合形式有aadA1-aadA22-aadA23、aadA1-aadA2-dfrA1-dfrA12-drfA15、aadA5-dfrA17、aadA1-aadA2-aadA29-dfrA1-dfrA12-dfrA15、aadA2-aadA28-dfrA12和aadA2-dfrA16。該研究中的整合子中出現的基因盒 dfrA1、dfrA12、dfrA15、dfrA16和dfrA17可以編碼二氫葉酸還原酶; aadA1、 aadA2、aadA5、aadA22、aadA23、aadA28、aadA29能促進腺苷轉移酶的表達。李琳等[11]對安徽地區的雞源大腸桿菌的整合子以及基因盒進行了檢測和分析，結果表明試驗的菌種中均檢測出 Ⅰ 型整合子，檢出率高達100%，其攜帶基因盒的種類主要包括5種，有3種組合形式流行。楊聰等[12]對寧夏地區的雞源耐藥性大腸桿菌進行了研究，結果發現 Ⅰ 型整合子的檢出率為75%，其中aadA5-dfrA17基因盒在該研究中也有出現。該研究與國內外研究[11-14]報道的大腸桿菌 Ⅰ 型整合子的檢出率十分相近，主要存在的基因盒包括aadA 和dfrA兩種 ，但基因盒的種類及其組合方式存在較大差異，可能與整合子的地區分布以及不同地區的用藥差異有關。Ⅰ 型整合子在不同地區不同動物源大腸桿菌內廣泛存在，尤其是各地區雞源大腸桿菌的耐藥基因盒流行普遍，證實了在對雞等禽類的飼養過程中用藥的不合理情況。

該研究對東北地區（包括黑龍江、吉林、遼寧）的雞源大腸桿菌樣本做了整合子-基因盒檢測試驗，結果發現雞源大腸桿菌整合子中 Ⅰ 型整合子的分布比較廣泛。與整合子的關系密切得主要為aadA和dfrA這2個基因，這2種基因也是在近幾年國內外報道中整合子介導的最常見的抗藥基因型[15]。 Ⅰ 型整合子對細菌的耐藥性和多重抗藥率、抗藥譜具有十分重要的作用，是能夠直觀體現多重抗藥性的一項重要指標。雞源大腸桿菌耐藥性產生的主要原因是由于臨床治療以及飼料中添加藥物導致，也有可能是由于環境污染（水源污染、土壤污染）所導致的耐藥性產生。在近幾年的國內外研究進展中，可以發現有些耐藥基因盒產生的原因主要是由于傳統的抗生素，而一些新型抗生素的耐藥基因盒在研究過程中很少出現，由此可見這些基因盒的廣泛傳播主要依賴于長時間的選擇壓力，而新型抗生素還未產生這種影響，但是整合子具有強大的從環境中獲取基因盒的能力，若不改善用藥情況，可能很快會造成新的耐藥基因盒的出現和廣泛傳播。因此，臨床用藥或在飼料中添加藥物時，應注意多種抗生素輪換使用，不要長期大量使用某種藥物，以減少抗生素的依賴性，避免產生和擴散細菌耐藥性，影響治療效果，造成經濟損失和其他嚴重后果。

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