擬南芥SPM12基因GFP載體構建及轉基因植株篩選

方雪 徐潔娜 孟杏楠 曹樹青 樊婷婷

摘要[目的]為了進一步研究SPM12基因的功能，利用哥倫比亞（Columbia，Col）遺傳背景的野生型擬南芥材料構建SPM12基因GFP載體及其轉基因植株。 [方法] 以野生型擬南芥的RNA反轉錄成的 cDNA為模板，PCR擴增出SPM12基因的CDS全長序列，將其連接到GFP載體的質粒上;然后將構建成功的重組質粒轉化到大腸桿菌DH5α受態細胞中，挑取陽性菌落經PCR鑒定并測序后，將其質粒轉入農桿菌GV3101感受態細胞中。PCR鑒定出陽性菌落后，通過浸花法將其轉入野生型擬南芥植株中。收種子后，使用帶有抗性的選擇性培養基篩選出陽性植株。[結果]通過SPM12基因CDS片段和SPM12-GFP重組質粒的獲得，構建了SPM12-GFP載體和其轉基因植株。 [結論]成功獲得擬南芥SPM12-GFP轉基因植株，為進一步研究擬南芥SPM12基因的功能與分子機制奠定了基礎。

關鍵詞擬南芥;SPM12;載體;GFP轉基因植株

中圖分類號Q939.9文獻標識碼A文章編號0517-6611（2019）02-0086-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.025

植物在其自然棲息地中經常面臨過多的非生物和生物脅迫。適應這種變化需要很大程度的表型可塑性，這主要取決于植物的基因組。目前尚不清楚植物是如何做到整合大量部分協同或拮抗的環境信號，從而使他們能夠在任何特定條件下做出響應[1]。但顯而易見的是，植物在應對各種脅迫時能夠做出相應的抵御反應。土壤中有害重金屬污染是世界范圍內日益迫切的問題，重金屬污染是對植物造成重大損害的因素之一[2-5]。筆者發現，SPM12基因使得擬南芥對重金屬鎘的脅迫有所響應，為進一步研究該基因的功能，通過構建SPM12基因GFP載體及其轉基因植株，研究SPM12基因在鎘脅迫響應中所起的作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗材料。該試驗使用的植物材料為哥倫比亞（Columbia，Col）遺傳背景的野生型（wild-type，Col-0）擬南芥（Arabidopsis thaliana），購于美國擬南芥種質資源中心。載體構建過程中所用大腸桿菌DH5α、農桿菌GV3101、載體pXB94-GFP均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.2主要試劑。TIANprep Mini Plasmid Kit和TIANprep Mini Purification Kit 購自天根生化科技（北京）有限公司;T4-DNA Ligase、限制性內切酶Kpn I和Eco RI購自NEB公司;Eazy Taq DNA Polymerase和Marker購自北京全式金生物技術有限公司; PrimeSTAR HS DNA Polymerase 購自TaKaRa公司;Silwet-77購自索萊寶公司;瓊脂、NaCl、氯仿、異丙醇、乙醇、蛋白胨、酵母粉、蔗糖均購自國藥集團;壯觀霉素、慶大霉素、卡那霉素均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2方法

1.2.1野生型擬南芥RNA的提取及其反轉錄。提前準備好研缽，洗干凈后放入65 ℃烘箱烘干水分。用錫箔紙包裹放入180 ℃烘箱，高溫烘4～6 h后，冷卻至室溫，放入-20 ℃預冷冰柜備用。同時將氯仿、異丙醇、乙醇放入-20 ℃冰柜中預冷處理。離心機提前設置到4 ℃預冷。稱取無菌培養2周左右的野生型擬南芥（WT）材料100～300 mg，置于預冷的研缽中，用無菌紙杯取適量液氮加入研缽中，將樣品材料在液氮中充分研磨成粉末;向研磨破碎后的材料中加入1 mL Trizol裂解液（4 ℃保存）繼續研磨成液體;轉移研磨完成后的材料至1.5 mL的離心管（EP）中，于超凈臺中室溫靜置5 min;加入200 μL氯仿后劇烈震蕩約15 s;繼續室溫靜置5 min后，13 000 r/min、4 ℃離心10 min;取上清液500 μL轉移至新的1.5 mL EP管中，并加入500 μL異丙醇，輕輕顛倒混勻6～8次，室溫靜置10 min;然后13 000 r/min、4 ℃離心15 min（在此期間配制足量75%乙醇）;棄上清，留沉淀，沿著EP管壁緩緩加入1 mL 75%乙醇，8 000 r/min、4 ℃離心5 min;充分棄去上清，在超凈臺靜置晾干5～8 min后，加入30～50 μL DEPC水，65 ℃水浴溶解10 min，每5 min敲打一次，溶解完畢后置于冰上，吸取2 μL進行濃度和純度檢測，根據檢測結果將所得RNA按反轉錄試劑盒說明書操作反轉錄成cDNA。

1.2.3酶切、連接與大腸桿菌的轉化。將所得目的基因片段和載體pXB94-GFP質粒用限制性內切酶KpnI和EcoRI在37 ℃下分別進行雙酶切2和4 h，瓊脂糖凝膠電泳后進行膠回收，使用T4-DNA Ligase將酶切后的基因片段和pXB94-GFP質粒在16 ℃下連接12 h。取5 μL連接產物加至40 μL大腸桿菌DH5α感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴30 min。然后42 ℃熱激50 s，迅速放冰上靜置2～3 min。加入600～800 μL無菌液體LB培養基，放置在37 ℃搖床中，220 r/min培養1 h。4 000 r/min離心5 min，棄去部分上清，留下約200 μL將菌體沉淀重懸并涂布于帶有50 mg/L的壯觀霉素抗性的固體LB培養基上，放在37 ℃培養箱中倒置過夜培養。挑取單菌落至裝有500 μL含50 mg/L壯觀霉素抗性的無菌液體LB培養基的EP管中，220 r/min、37 ℃培養至培養基渾濁，進行菌落PCR鑒定陽性菌株。

1.2.4農桿菌的轉化。用測序比對正確的陽性菌落擴大培養并提取出重組質粒。取重組質粒2 μL，加入50 μL GV3101感受態細胞，混勻后移至預冷的電擊杯中，1 800 V電擊;電擊完成后迅速取出，加入600～800 μL無菌液體LB培養基，使用移液槍吹打混勻，盡可能多的將混合液移入無菌的1.5 mL EP管中，放入28 ℃搖床220 r/min培養3 h;4 000 r/min離心5 min。棄去部分上清，留下約200 μL將菌體沉淀重懸并涂布于帶有50 mg/L壯觀霉素和50 mg/L慶大霉素雙抗性的固體LB培養基上，放在28 ℃培養箱倒置培養約48 h;挑取單菌落至裝有500 μL含50 mg/L壯觀霉素和50 mg/L慶大霉素雙抗性的無菌液體LB培養基的EP管中，220 r/min、28 ℃培養至培養基渾濁，進行菌落PCR鑒定陽性菌株。并使用50%甘油將陽性菌株保存一部分于-80 ℃冰箱留作菌種。

1.2.5浸花法轉基因。將含有表達載體的陽性克隆擴大培養，5 000 r/min離心5 min收集菌體。用MS/蔗糖緩沖液重懸后，再次離心收集。用緩沖液再次重懸至OD600=0.5，按照1∶4 000的比例加入Silwet-77。剪去野生型擬南芥的果莢和已授粉的花，將未授粉得到花浸入侵染緩沖液約20 s后，裹上保鮮膜黑暗過夜培養，揭去保鮮膜后22 ℃正常培養。1周后，再次侵染。

1.2.5

轉基因植株的篩選。 收到擬南芥侵染后的第一代種子后，篩去雜質，放置于37 ℃烘箱干燥15 d，然后密封放在4 ℃冰箱春化1周左右。使用時在超凈臺先用0.1%的氯化汞消毒1次，并用無菌水洗滌3次，將洗滌過的種子用無菌牙簽撥置于無菌濾紙上。待種子晾干后，撒在含50 mg/L卡那霉素的MS固體培養基上，用封口膜密封后置于4 ℃冰箱春化3 d。春化后，將培養基放在恒溫22 ℃光照培養箱培養2周。因為卡那霉素能夠影響植物葉綠體和線粒體的蛋白合成從而引起植物黃化而死亡，而轉基因植物由于帶有卡那抗性能夠抑制卡那的作用，所以能夠通過卡那培養基篩選出轉基因植株。對有陽性植株的培養皿進行拍照，并將陽性植株移栽土培。土培2周后可選蓮座葉提取DNA進行PCR復驗證。

2結果與分析

2.1目的片段的PCR擴增

利用無菌培養2周的擬南芥提取的RNA反轉錄出的cDNA通過PCR擴增出目的基因SPM12的片段，該片段長度為561 bp，從圖1中瓊脂糖凝膠電泳的結果來看，擴增出的條帶與該基因片段的長度相吻合。通過瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收基因片段。

2.2目的基因與pXB94-GFP質粒的雙酶切

由于在設計克隆目的基因的引物時根據不同載體所攜帶的酶切位點，選擇性設計了2個最優的酶切位點KpnI和EcoRI分別加在上下游引物的5′端。取30 μL基因片段和20 μL pXB94-GFP質粒的溶液，每個限制性內切酶各加1 μL，相應各加入5 μL的Cutsmart，用ddH2O配足50 μL，目的基因酶切時間為2 h，pXB94-GFP質粒的酶切時間為4 h。圖2中雙酶切的結果顯示酶切效果良好，無拖尾，無雜帶。條帶大小與目的基因和質粒分別相符。用膠回收試劑盒回收酶切產物。使用T4-DNA Ligase將酶切后的目的基因與pXB94-GFP質粒載體在16 ℃的金屬浴中連接12 h。

2.3大腸桿菌重組質粒陽性菌落的PCR鑒定

將連接產物通過化學轉化法轉入大腸桿菌DH5α的感受態細胞中，涂布在壯觀霉素抗性的LB固體培養基上過夜后，挑取陽性菌落培養一定時間，通過PCR鑒定獲得陽性菌落，圖3為大腸桿菌重組質粒陽性菌落PCR鑒定的瓊脂糖凝膠電泳結果，顯示與目的基因大小符合。經過測序比對，得到含目的基因的重組質粒載體。

2.4農桿菌陽性克隆的PCR鑒定

用質粒小提試劑盒提取測序比對正確的大腸桿菌重組質粒，并提取出的重組質粒通過電轉化法轉入農桿菌GV3101感受態細胞中，在含有50 mg/L慶大霉素和壯觀霉素雙抗性的LB固體培養基上28 ℃培養2 d左右，挑取單菌落活化，然后進行菌落PCR鑒定。農桿菌陽性菌落的瓊脂糖凝膠電泳結果（圖4）說明，目的基因成功轉入農桿菌。

2.5轉基因陽性植株的抗性篩選

通過浸花法侵染野生型擬南芥，將收到的種子撒在帶有卡那霉素抗性的MS固體培養基上，陽性植株會正常生長（圖5），陰性植株因不含轉基因攜帶的抗性而黃化死亡。2周后，將陽性株系移栽土培。

為進一步驗證轉基因成功的株系，提取轉基因株系的DNA進行PCR鑒定，如圖6，成功擴增出SPM12的CDS片段，從而更進一步地確定了陽性植株為轉基因成功的株系，也說明成功構建了擬南芥SPM12基因的GFP載體并得到了相應的轉基因植株。

3討論

自然界中和人為造成的重金屬污染對很多農業土壤造成不同程度的污染。人為造成的污染主要包括工業生產活動以及農業活動中使用的含有重金屬的肥料[6-7]。受到重金屬污染的土壤會造成很多農作物產品如各種水果與蔬菜中含有很高的重金屬成分[8-9]。鎘是重金屬污染中最危險的因素之一，對植物和農作物具有很強的毒性，鎘能夠通過與巰基結合使得蛋白質變性失活，從而造成動植物的細胞損傷[10-13]。通過研究對重金屬脅迫有所響應的基因有助于篩選出優質的農作物品種。由于SPM12基因能夠對鎘脅迫做出應答，通過SPM12基因的GFP載體和該基因的GFP轉基因株系的構建，對后續研究該基因的功能與分子機制做出了一定的貢獻，對農業生產、食品安全有重要意義。

參考文獻

[1] PANDEY S P，SOMSSICH I E.The role of WRKY transcription factors in plant immunity[J].Plant physiology，2009，150（4）：1648-1655.

[2] SHI W Y，SHAO H B，LI H，et al.Progress in the remediation of hazardous heavy metalpolluted soils by natural zeolite[J].Journal of hazardous materials，2009，170（1）：1-6.

[3] GJORGIEVA D，KADIFKOVAPANOVSKA T，RUSKOVSKA T，et al.DNA-damage and total antioxidant status in two selected medicinal plants subjected to heavy metal phytotoxicity[C]// Conference on medicinal and aromatic plants of southeast European countries.[s.l.]：[s.n]，2012：127-127.

[4] SYTAR O，KUMAR A，LATOWSKI D，et al.Heavy metal-induced oxidative damage，defense reactions，and detoxification mechanisms in plants[J].Acta physiologiae plantarum，2013，35（4）：985-999.

安徽農業科學2019年

[5] SHAW B P，SAHU S K，MISHRA R K.Heavy metal induced oxidative damage in terrestrial plants[M]//PRASAD M N V.Heavy metal stress in plants.Berlin Heidelberg：SpringerVerlag，2004：84-126.

[6] LEE J，BAE H，JEONG J，et al.Functional expression of a bacterial heavy metal transporter in Arabidopsis enhances resistance to and decreases uptake of heavy metals[J].Plant physiology，2003，133（2）：589-596.

[7] ROSS S M.Sources and forms of potentially toxic metal in soil-plant system[M]// ROSS S M.Toxic metals in soil-plant systems.New York：John Wiley & Sons，1994：3-25.

[8] SHAFFER M.Waste lands：The threat of toxic fertilizer[M].Los Angeles，CA：Californias Advocate for the Public Interest，2001.

[9] MENCH M J.Cadmium availability to plants in relation to major long-term changes in agronomy systems[J].Agric Ecosyst Environ，1998，67（2/3）：175-187.

[10] RASKIN I，SMITH R D，SALT D E.Phytoremediation of metals：Using plants to remove pollutants from the environment[J].Curr Opin Biotechnol，1997，8（2）：221-226.

[11] SHIM D，HWANG J U，LEE J，et al.Orthologs of the class A4 heat shock transcription factor HsfA4a confer cadmium tolerance in wheat and rice[J].Plant cell，2009，21：4031-4043.

[12] GALLEGO S M，PENA L B，BARCIA R A，et al.Unravelling cadmium toxicity and tolerance in plants：Insight into regulatory mechanisms[J].Environ Exp Bot，2012，83：33-46.

[13] GOYER R A.Toxic and essential metal interactions[J].Annu Rev Nutr，1997，17：37-50.